郭文燕 童雅琪 余雅琦 周勝男 常 超* 伍金娥，2

（1 武漢輕工大學食品科學與工程學院 武漢430023 2 武漢輕工大學 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室 農(nóng)產(chǎn)品加工與轉化湖北省重點實驗室武漢430023）

大腸桿菌O157：H7 （Escherichia coli O157：H7）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為典型的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的代表菌，是引起人和動物感染的常見病原菌，也是引發(fā)食品中毒的重要病原菌[1-2]。特別是大腸桿菌O157：H7是國內(nèi)外疾病控制中心（CDC）重點關注的食源性致病菌之一，無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家均有大腸桿菌0157：H7 導致食物中毒事件發(fā)生，已成為威脅全球人群健康的重要公共衛(wèi)生問題[3]?？刂七@類食源性病原菌的傳播與爆發(fā)一直是食品加工企業(yè)重點關注的問題。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，簡稱ε-PL）是一種由賴氨酸單體分子在α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接成的均聚氨基酸。這類直鏈多聚體約由20～30 個賴氨酸殘基組成，由一類白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）代謝產(chǎn)生[4-5]。由于ε-PL 在體內(nèi)可以分解為人體必需的L-賴氨酸，因此ε-PL 也被認為是一種高安全性的天然食品防腐劑，具有抗菌譜廣，水溶性好的特點，具有潛在的商業(yè)利用價值[6-8]，已于2003年10月被FDA 批準為安全食品保鮮劑。目前我國已批準ε-PL 作為食品防腐劑應用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁[9]。對其抗菌機理的研究表明，它能夠通過靜電作用吸附到微生物表面，破壞其細胞膜結構的完整性，進而影響微生物生長繁殖，它能夠抑制包括革蘭氏陽性菌、陰性菌、霉菌和酵母菌在內(nèi)的多種微生物的生長繁殖，且抑菌能力強[10]。從應用角度來講，ε-PL 能否與其它物質(zhì)配合使用，提高ε-PL 的抗菌活性是一個值得探討的科學問題，對此也進行了大量研究[11-13]。加工溫度、pH 值、金屬離子是食品加工涉及的三大要素，明確ε-PL 在不同條件下對病原菌抗菌活性的穩(wěn)定性，是提高ε-PL 抗菌活性，指導ε-PL 應用提供必要的理論基礎。

本研究采用微量液體稀釋法，首先找出ε-PL對兩種代表性的食源性病原菌的最小抑菌濃度即MIC 值，再研究不同加工溫度、pH 條件下ε-PL 和ε-PL 與金屬離子共同作用對各種菌的抑菌效果，判斷其穩(wěn)定性，旨在為合理應用ε-PL 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑 ε-PL，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；純度為99%，硫酸鋅、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、硫酸錳均為化學純級試劑。金黃色葡萄球菌，武漢大學微生物菌種保藏中心；大腸桿菌O157：H7，武漢輕工大學生命工程學院微生物教研室。

1.1.2 儀器與設備 SW-CJ-2FD 雙人超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱、GHP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司；UPK-I-10T 超純水儀，成都超純科技有限公司；BCD-219K 冰箱，青島海爾股份有限公司；BS2240 電子天平，德國賽多利斯；YXQ-LS-70A 自動高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；DK-S11 恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-3C 精密pH 計，上海雷磁儀器廠；Enspire 酶標儀，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，按常規(guī)制備培養(yǎng)基的方法制備，121 ℃滅菌15 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 ε-PL 最小抑菌濃度（MIC）的測定 精確稱取適量的ε-PL 干粉，溶于無菌水中，配制樣液比為1∶6 的ε-PL 溶液。在無菌條件下采用微量稀釋法測定ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC），取2 個無菌的96 孔板，將ε-PL 溶液用無菌水在96 孔板中進行二倍稀釋，在兩個96 孔板中分別加入不同的菌懸液（1×106CFU/mL），混均后置于培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，再將96 孔板置于波長600 nm 的光密度測定儀，測其光密度值（OD 值）。MIC 值為完全抑制細菌生長所需的抑菌物質(zhì)最低濃度，反應抑菌劑抑菌能力的大小。用肉眼觀察溶液的渾濁情況與OD 值相結合的方法，判定MIC 值的大小。

1.2.2 不同pH 值對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 調(diào)節(jié)濃度為4MIC 的ε-PL 溶液的pH 值為4，5，6，7，8，9，作用一段時間后，取2 個無菌的96 微孔板置于超凈臺上，將上述不同pH 值的ε-PL 溶液、無菌水和兩種菌懸液（1×106CFU/mL）分別加入對應的96 微孔板中，使菌懸液終濃度相同以及ε-PL 的終濃度分別為1/4MIC，1/2MIC，MIC，2MIC，混均后放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。測OD 值，比較不同pH 值條件下提取液的抑菌穩(wěn)定性，確定其pH 值活性范圍。

1.2.3 不同溫度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 將濃度為4MIC 的ε-PL 溶液分別在4，20，40，60，80，100，121 ℃條件下處理30 min，方法同1.2.2，測OD 值，觀察溶液的渾濁情況，考察ε-PL 的熱穩(wěn)定性。

1.2.4 不同金屬離子及其濃度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 分別配制0.1 mol/L 的KCl，NaCl，ZnSO4，MnSO4，CaCl2，MgCl2溶液，將金屬離子用無菌水在96 孔板中進行二倍稀釋，然后將濃度為2MIC 的ε-PL 溶液、 無菌水和兩種菌懸液（1×106CFU/mL）分別加入對應的96 微孔板中，使金屬離子終濃度分別為0，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 mmol/L，ε-PL 的終濃度分別為1/5MIC，2/5MIC，4/5MIC 以及菌懸液終濃度相同?；炀蠓湃牒銣嘏囵B(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察微孔中溶液的渾濁度，測定OD 值。結果用細菌生長的抑制率來表示。

抑制率（%）= [（對照組OD600-Men+聯(lián)合處理組OD600）/對照組OD600]×100

2 結果與分析

2.1 ε-PL 對各菌的最小抑菌濃度（MIC）

不同質(zhì)量濃度的ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 抑制趨勢見圖1。ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7的抑制隨著質(zhì)量濃度的增加而增強，當質(zhì)量濃度超過2.6 mg/mL 時，OD 值趨于平緩，并且培養(yǎng)液澄清透明，由此判斷ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 最小抑菌濃度均為2.6 mg/mL，該 溶 液 環(huán) 境 的pH 值 為6.87，這 與Geornaras 等[14]的研究結果相符合，說明ε-PL 應為一廣譜抗菌素，對革蘭氏陽性與革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌效果。

圖1 不同質(zhì)量濃度ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 生長的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of ε-PL against S.aureus and E.coli O157：H7

2.2 不同溫度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）影響

由圖2可知，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加，對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強。在本試驗設置溫度下處理30 min 對ε-PL的抑菌效果影響并不顯著，經(jīng)過各個溫度處理的ε-PL 在最小抑菌濃度（MIC）與細菌共同培養(yǎng)的溶液仍然呈澄清透明狀態(tài)，說明熱處理不影響其抗菌活性，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7具有良好的抑菌效果，并且抑菌效果穩(wěn)定。倪清艷等[15]用牛津杯抑菌試驗測定的最高溫度為121 ℃下處理20 min，呈現(xiàn)出較穩(wěn)定的抗菌活性，與本試驗中采用的微量稀釋法測定121 ℃下處理30 min的結果基本一致。因此，本結果進一步證實了不同溫度處理后的ε-PL，其抗菌活性并不受影響，從分子結構上可能并未發(fā)生顯著變化，表明這一抗菌素適合用于冷、熱食品的保藏，還能夠承受一般食品加工過程中的熱處理，可以隨原料一同做滅菌處理，有效阻止二次污染。

2.3 不同pH 值對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響

由圖3可知，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加，對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強。隨著pH 值的升高，ε-PL 對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌能力呈相似的變化趨勢，均呈下降趨勢，經(jīng)過pH 值為4～5 處理的ε-PL，其終濃度為1/2MIC 時與細菌共同培養(yǎng)的溶液呈澄清透明，說明當pH 值為4～5 時，其最小抑菌濃度為1/2MIC，即在酸性條件下，ε-PL 具有非常好的穩(wěn)定性，抑菌效果較堿性條件下顯著。該試驗結果與前人報道采用ε-PL 與醋酸復合作用對耐熱性較強的枯草芽孢桿菌等芽孢菌的抑制效果優(yōu)于單獨使用時的抑菌效果的結論相似。在堿性條件下處理的ε-PL，其終濃度為2MIC 時與細菌共同培養(yǎng)的溶液呈澄清透明，說明當pH 值為7～9 時其最小抑菌濃度為2MIC，可能是在堿性條件下，使得ε-PL 抗菌活性降低；這點對于食品保鮮尤為重要，提示ε-PL 可以用于酸性食品的貯藏保鮮，而在用于堿性食品保藏時，需提高ε-PL 質(zhì)量濃度方可起到殺菌效果。

圖2 不同溫度對ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響Fig.2 Effect of thermal treatments on antibacterial activity of ε-PL

圖3 不同pH 值對ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH values on antibacterial activity of ε-PL

2.4 不同金屬離子及濃度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響

在1/5MIC，2/5MIC，4/5MIC 的ε-PL 溶液加入金屬離子，對大腸桿菌O157：H7 及金黃色葡萄球菌作用結果分別如圖4與圖5所示。

圖4 不同金屬離子對ε-聚賴氨酸抑制大腸桿菌O157：H7 效果的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of ε-PL against E.coli O157：H7

圖4顯示，Zn2+與Mn2+對大腸桿菌O157：H7造成的抑制效應最強，呈劑量反應關系，Zn2+為0.15625 mmol/L，即可表現(xiàn)出增效作用，Mn2+與ε-PL 溶液濃度為2/5MIC，在5 mmol/L 出現(xiàn)十分顯著的增效作用。不同濃度的Na+、K+與ε-PL 作用僅表現(xiàn)出十分有限的抑制效應，而Mg2+呈現(xiàn)出抵消殺菌效應。天然防腐劑ε-PL 對微生物的抑制機制主要表現(xiàn)為破壞膜結構以及完整的能量代謝系統(tǒng)，從而抑制細胞膜的呼吸作用，導致胞內(nèi)溶酶體膜破裂而誘導微生物產(chǎn)生自溶作用。在革蘭氏陰性菌體細胞壁上，脂多糖帶負電荷，能吸附Mg2+以提高這些離子在細胞表面濃度的作用，起到穩(wěn)定細胞壁結構的作用[16]。因此，從本試驗結果來看，Mg2+呈現(xiàn)出抵消ε-PL 殺菌效應，對微生物具有保護作用。

圖5 不同金屬離子對ε-聚賴氨酸抑制金黃色葡萄球菌效果的影響Fig.5 Effect of metal ions on antibacterial activity of ε-PL against S.aureus

金屬離子和ε-PL 溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如圖5所示，Zn2+或Mn2+加至ε-PL，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加對金黃色葡萄球菌造成的抑制效應逐漸增強，隨后趨于穩(wěn)定；ε-PL 在3 種質(zhì)量濃度下與不同濃度的Na+，K+，Ca2+作用，僅表現(xiàn)出較弱的抑制效應。Mg2+與3 種不同質(zhì)量濃度的ε-PL 共同作用于金黃色葡萄球菌時，反而表現(xiàn)出增殖效益，促進了細菌的生長，且呈劑量效應關系；因此，Mg2+可以消除ε-PL 的抑菌效應，可能由于革蘭氏陽性細菌細胞壁，與磷壁酸 （teichoicacid）相似，也帶負電荷，通過靜電吸附作用濃縮細胞周圍的Mg2+，以提高細胞膜上一些合成酶的活性[16]。盡管本試驗中其它金屬離子均帶正電荷，但卻沒有發(fā)生與Mg2+的作用效應，這種現(xiàn)象可能與酶對金屬離子的選擇性有關。

3 結論

在食品加工工業(yè)中，溫度、pH 值、金屬離子是影響食品品質(zhì)的三大要素，研究其對ε-PL 對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性和以大腸桿菌O157：H7 為代表的革蘭氏陰性菌的殺菌效果的影響，能為合理應用ε-PL 提供理論依據(jù)。

本研究結果表明，ε-PL 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好的抑菌效果；在酸性條件下ε-PL 較穩(wěn)定，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 的抑菌效果較好，降低pH 值能使最小抑菌濃度有所減小，在堿性條件下活性降低，結果提示ε-PL 能良好用于酸性食品的貯藏保鮮，在堿性環(huán)境下，需提高ε-PL 的使用劑量；在4～121 ℃下，ε-PL 的熱穩(wěn)定性較好；Mn2+、Zn2+與ε-PL 具有較高的協(xié)同作用，應避免與Mg2+混合使用，這一結果為ε-PL 用于抗菌膜等的形式提供了理論依據(jù)。