韓曉樂(lè)，李擎宇，郝 浩，劉晨音，雷佳文，于 帆,胡軍成

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢,430074)

硒酸鈉(Na2SeO4，別名無(wú)水硒酸鈉)是自然界中硒的主要無(wú)機(jī)化合物之一，主要被用于癌癥的治療[8-13]。臨床試驗(yàn)證明硒是可以作為很多癌癥化學(xué)療法的藥劑[14]。雖然大量實(shí)驗(yàn)表明硒對(duì)癌有抑制作用，但其抑制機(jī)理并不十分清楚。具有重要應(yīng)用前景的微量元素硒與生物大分子相互作用的報(bào)道也較少。隨著微量元素硒在生命科學(xué)中的廣泛應(yīng)用，考慮到其抗癌藥物的活性與重要的醫(yī)用價(jià)值，研究其與牛血清白蛋白的相互作用顯得非常有意義,為此，本文在模擬動(dòng)物體生理?xiàng)l件下, 采用熒光光譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜等方法研究不同溫度下硒酸鈉與牛血清白蛋白的相互作用，并通過(guò)計(jì)算二者相互作用時(shí)的熱力學(xué)參數(shù)及檢測(cè)硒酸鈉對(duì)牛血清白蛋白構(gòu)象的影響，對(duì)其相互作用機(jī)理進(jìn)行分析，以期為微量元素硒在生命科學(xué)中的應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

帶恒溫系統(tǒng)的LS55熒光光度計(jì)(美國(guó)Perkinelmer公司)、TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；牛血清白蛋白(BSA)、Na2SeO4、Tris-base(三羥甲基氨基甲烷)、濃HCl,以上試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 溶液配制

配制濃度為0.05 mol/L、pH = 7.4的Tris-HCl緩沖溶液：稱(chēng)量6.057 g三羥甲基氨基甲烷置于l L燒杯中，加入約800 mL去離子水，使其充分溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH=7.4。將溶液定容至1 L，高溫高壓滅菌后，放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

配制濃度為5.0×10-6mol/L的 BSA溶液:稱(chēng)量6.800 g的BSA，加入至20 mL新制的Tris-HCl緩沖液中，使其溶解消泡后，轉(zhuǎn)移保存于4 ℃冰箱中備用。

配制濃度為1.0×10-3mol/L 的Na2SeO4溶液：稱(chēng)取0.944 mg的Na2SeO4，加入至3 mL去離子水中，充分溶解后，將溶液定容至5 mL備用。

配制BSA-Na2SeO4體系溶液：在298、304、310 K溫度下，取3 mL濃度為5.0×10-6mol/L的BSA溶液于比色皿中，然后分別取3 μL濃度為1.0×10-3mol/L 的Na2SeO4溶液對(duì)BSA溶液進(jìn)行連續(xù)滴定，配制BSA-Na2SeO4體系溶液，其中Na2SeO4的滴定終態(tài)濃度分別為：0、1.67×10-6、3.33×10-6、5.00×10-6、6.67×10-6、8.33×10-6、10.00×10-6、11.67×10-6mol/L。

1.3 表征

熒光光譜：選定激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度分別為10.0、5.0 nm，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm下測(cè)定Na2SeO4-BSA體系在298、304、310 K溫度下的熒光光譜。

中國(guó)共產(chǎn)黨在山東抗日根據(jù)地的文化動(dòng)員工作一直以宣傳抗日政策，提高民眾文化素質(zhì)為主要方向，各級(jí)黨組織致力于揭露日偽的罪行和奴化教育的真實(shí)面目，打擊和駁斥妥協(xié)投降的亡國(guó)謬論，發(fā)展各級(jí)學(xué)校教育，提高民眾文化素質(zhì)和政治覺(jué)悟，堅(jiān)定廣大軍民的抗戰(zhàn)決心，配合根據(jù)地各項(xiàng)工作的開(kāi)展。這些工作為抗戰(zhàn)勝利和新民主主義文化的發(fā)展產(chǎn)生了重要作用。

紫外-可見(jiàn)吸收光譜：測(cè)定在溫度為298 K、pH=7.4的條件下所配制的不同濃度的Na2SeO4-BSA體系溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

三維熒光光譜：在激發(fā)波長(zhǎng)為200 nm、掃描波長(zhǎng)為290～480 nm范圍內(nèi)，測(cè)定Na2SeO4-BSA體系的三維熒光光譜，掃描圈數(shù)為31。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Na2SeO4對(duì)BSA熒光光譜的影響

在溫度為 298 K下，不同濃度的Na2SeO4對(duì)BSA熒光光譜的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，Na2SeO4對(duì)BSA的熒光能產(chǎn)生猝滅效應(yīng)，且隨著Na2SeO4濃度逐漸增大，BSA熒光強(qiáng)度發(fā)生有規(guī)律的猝滅， 其最大發(fā)射波長(zhǎng)從343 nm 紅移至352 nm,表明BSA與Na2SeO4發(fā)生了相互作用，BSA的發(fā)色團(tuán)微環(huán)境發(fā)生了改變，使色氨酸(Trp)殘基更加裸露，即色氨酸所處環(huán)境的疏水性減弱，極性增強(qiáng)。

圖1 不同濃度的Na2SeO4對(duì)BSA熒光光譜的影響

Fig.1 Effects of different concentrations of Na2SeO4on fluorescence spectra of BSA

2.2 Na2SeO4與BSA相互作用的機(jī)制

熒光猝滅主要包含動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、混合型猝滅等[15]。熒光體與猝滅劑分子間的相互作用可用Stern-Volmer方程[16]進(jìn)行描述，即

(1)

式中：F0為未加入猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑Na2SeO4后BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑Na2SeO4的濃度, mol/L;Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)， L/mol。

不同溫度下Na2SeO4猝滅BSA熒光的Stern-Volmer關(guān)系圖如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著溫度的升高，Stern-Volmer猝滅常數(shù)(Ksv)不斷減小，由此表明，溫度升高，猝滅劑Na2SeO4與BSA形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，溫度升高不利于猝滅過(guò)程的進(jìn)行，進(jìn)而推測(cè)Na2SeO4與BSA相互作用形成了某種特定結(jié)構(gòu)的基態(tài)配合物，表明Na2SeO4對(duì)BSA熒光猝滅為靜態(tài)熒光猝滅。

圖2 不同溫度下Na2SeO4猝滅BSA熒光的Stern-Volmer關(guān)系圖

Fig.2 Stern-Volmer relationship of Na2SeO4quenching BSA fluorescence at different temperatures

靜態(tài)熒光猝滅作用是指熒光體分子與熒光猝滅劑分子之間借助分子間力結(jié)合形成了具有一定結(jié)構(gòu)的超分子配合物、從而導(dǎo)致熒光體熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象, 靜態(tài)的猝滅數(shù)據(jù)可以用修正的Stern-Volmer方程[17]處理, 即

(2)

式中：fa為可被熒光猝滅劑接近的發(fā)色基團(tuán)占總的發(fā)色基團(tuán)的百分比；Ka為靜態(tài)熒光猝滅過(guò)程中復(fù)合物的形成常數(shù), L/mol，它反映了在靜態(tài)猝滅過(guò)程中生物大分子與熒光猝滅劑分子的結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的量效關(guān)系。

不同溫度下Na2SeO4猝滅BSA熒光修正的Stern-Volmer關(guān)系圖如圖3所示。從圖3中可以看出，靜態(tài)猝滅常數(shù)Ka隨著溫度的升高而增大，表明Na2SeO4對(duì)BSA的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅,而符合靜態(tài)猝滅機(jī)制，進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的推測(cè)， Na2SeO4與BSA相互作用引起熒光猝滅并形成了基態(tài)配合物。

圖3 不同溫度下Na2SeO4猝滅BSA熒光的修正的Stern-Volmer關(guān)系圖

Fig.3ModifiedStern-VolmerrelationshipofNa2SeO4quen-ching BSA fluorescence at different temperatures

在溫度為298 K、pH=7.4的條件下，不同濃度的Na2SeO4對(duì)BSA紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響如圖4所示。從圖4中可以看出，對(duì)加入不同濃度的Na2SeO4后的BSA與未加入Na2SeO4空白的BSA的紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行比較，在吸收波長(zhǎng)為280 nm附近，加入Na2SeO4后，BSA的紫外-可見(jiàn)吸收光譜發(fā)生了明顯變化，且隨著Na2SeO4濃度的增加，Na2SeO4-BSA體系的吸光度逐步增強(qiáng)，進(jìn)一步表明Na2SeO4與BSA基態(tài)分子間發(fā)生作用是BSA熒光猝滅的根本原因。

圖4 不同濃度的Na2SeO4對(duì)BSA紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響

Fig.4 Effects of Na2SeO4with different concentrations on uv-vis absorption spectra of BSA

2.3 Na2SeO4與BSA相互作用模式

對(duì)于靜態(tài)猝滅過(guò)程，小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用通常包括靜電作用力、疏水力、氫鍵、范德華力和空間位阻排斥力等[18]。根據(jù)相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以近似地判斷出生物活性小分子與生物大分子之間的主要作用力類(lèi)型。利用Van’t Hoff方程可以計(jì)算Na2SeO4與BSA反應(yīng)的焓變和熵變，進(jìn)而得到不同溫度下反應(yīng)自由能變(ΔG)，即

(3)

式中：K為Na2SeO4與BSA的結(jié)合常數(shù)， L/mol；R為摩爾氣體常數(shù)；ΔH為反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)焓變, kJ/mol;ΔS為反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)熵變, J/(mol·K);T為反應(yīng)溫度，K。

以lnK對(duì)1/T作圖，由斜率和截距分別計(jì)算出焓變(ΔH)和熵變(ΔS),則不同溫度下Na2SeO4與BSA之間的反應(yīng)自由能變(ΔG)可表示為：

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

不同溫度下Na2SeO4與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)如表1所示。從表1中可以看出，ΔG<0, ΔH<0，ΔS>0，表明Na2SeO4與BSA之間的相互作用模式主要是以靜電相互作用為主，且是一個(gè)自發(fā)的反應(yīng)。

表1 不同溫度下Na2SeO4與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

Table 1 Thermodynamic parameters of interaction between Na2SeO4and BSA at different temperatures

T/KΔH/kJ·mol-1ΔS/J·mol-1·K-1ΔG/kJ·mol-1298-78.2340.6-18.0304-78.2340.6-18.2310-78.2340.6-18.4

2.4 Na2SeO4與BSA間的結(jié)合平衡

根據(jù)小分子與大分子配位方程，將BSA的熒光強(qiáng)度與猝滅劑Na2SeO4的濃度關(guān)系由熒光物質(zhì)與猝滅劑間的結(jié)合表達(dá)式[19]求出，即

(5)

式中：Kb為Na2SeO4與BSA的表觀結(jié)合常數(shù), L/mol；n為它們之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

由式(5)求出不同溫度下Na2SeO4與BSA作用的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，列于表2。從表2中可以看出，隨著溫度的升高，表觀結(jié)合常數(shù)(Kb)不斷地減小，當(dāng)接近人體體溫(310 K)時(shí)，表觀結(jié)合常數(shù)最小，表明在人體體溫范圍內(nèi)，Na2SeO4與BSA結(jié)合較弱，其毒性應(yīng)該也較弱，結(jié)合位點(diǎn)(n)約為1，表明BSA與Na2SeO4相互作用形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表2 不同溫度下Na2SeO4與BSA作用的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)

Table 2 Apparent binding constants and binding sites of Na2SeO4and BSA at different temperatures

T/KKb/104 L·mol-1nR22982.21.0230.9983041.71.0920.9983101.21.0810.995

2.5 Na2SeO4對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

利用三維熒光光譜檢測(cè)Na2SeO4與BSA發(fā)生相互作用后Na2SeO4對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。BSA及Na2SeO4-BSA體系的三維熒光譜圖如圖5所示。從圖5中可以看出，加入Na2SeO4后，BSA的瑞利散射峰起始位置無(wú)明顯變化，但BSA熒光峰(峰1)強(qiáng)度略有減弱，其熒光強(qiáng)度從498.6減小至437.2，進(jìn)一步表明Na2SeO4對(duì)BSA有熒光猝滅作用；同時(shí)BSA的熒光峰(峰1)的位置略有變化，發(fā)射峰位置從342 nm 藍(lán)移至339 nm, 表明Na2SeO4對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響。

(a)BSA

(b)BSA-Na2SeO4體系

Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of BSA and BSA-Na2SeO4system

3 結(jié)論

(1)硒酸鈉對(duì)牛血清白蛋白的熒光有猝滅效應(yīng)，二者反應(yīng)形成復(fù)合物，硒酸鈉對(duì)牛血清白蛋白熒光猝滅的方式屬于靜態(tài)猝滅。

(2)硒酸鈉與牛血清白蛋白主要靠靜電相互作用力結(jié)合，且相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

(3)硒酸鈉與牛血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，它們之間可以形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

(4)在較小的濃度下，硒酸鈉對(duì)牛血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響。