鐘喻

摘要本研究利用水蒸餾法提取碰碰香揮發(fā)油，采取抑菌圈法對碰碰香揮發(fā)油的抑茵活性進行初探。結(jié)果表明，長有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了比較明顯的抑菌圈，證明碰碰香揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有很好的抑茵效果。

關(guān)鍵詞 碰碰香 水蒸汽蒸餾法 抑菌效果

中圖分類號Q-33 文獻標志碼B

一般具有刺激性氣味或香味的植物都含有精油，精油特別容易揮發(fā)，又稱作揮發(fā)油，是存在于植物體內(nèi)、能夠隨著水蒸氣一同被蒸餾出來的油狀物質(zhì)的總稱。精油大部分是植物體內(nèi)濃縮的精華，一般由幾十種甚至幾百種化合物組成，在室溫下為具黏稠性的、淺黃色液體，易溶于有機溶劑，不溶于水，具有殺滅細菌、消除炎癥、鎮(zhèn)定皮膚、驅(qū)除蚊蟲的作用。近年來，植物精油對細菌的抑菌活性研究引起廣泛的關(guān)注，許多精油都表現(xiàn)出良好的抑菌活性和廣譜性，對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有很好的抑菌效果。研究表明，革蘭氏陽性菌對植物精油的敏感性要大于革蘭氏陰性菌，如羅勒精油和佛手柑精油對革蘭氏陽性菌有很好的抑制效果。目前，國內(nèi)外對植物精油的抑菌機理研究有一定的進展，主要總結(jié)為：①影響細菌細胞膜的通透性;②影響細菌細胞代謝途徑;③造成DNA的損傷。

本次實驗選擇的實驗植物是碰碰香，屬于唇形科延命草屬植物，又名一抹香、觸留香，學(xué)名為Plectran-thushadiensisvar.tomentosus（Benth.ex E.Mey.）。莖枝為棕色，鮮嫩的莖葉呈綠色，葉片卯圓形，表面光滑，邊緣有細疏的小鋸齒。由于經(jīng)人觸碰，會散發(fā)出香味，而且香味會殘留在手上，因此得名“碰碰香”。這種特殊的香味使碰碰香具有很好的觀賞價值、食用價值，還有驅(qū)蚊和凈化空氣的效果。同時，實驗以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為供試菌，運用水蒸汽蒸餾法從碰碰香葉片中提取碰碰香揮發(fā)油，初步探究碰碰香揮發(fā)油對兩種細菌的抑菌活性，為碰碰香揮發(fā)油的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗儀器及材料

實驗材料：碰碰香的葉片。

指示菌菌種：標準革蘭氏陽性菌——金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;標準革蘭氏陰性菌——大腸桿菌（Escherichia coli）。以上兩個菌種均為實驗室的冰箱保存。

實驗儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、凈化工作臺、電熱鼓風干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、全溫度大容量振蕩培養(yǎng)箱、電子天平、循環(huán)水真空泵、三角涂布棒、燒杯、打孔機、玻璃棒、錐形瓶、濾紙、電子天平、刻度尺、涂布棒、移液槍、酒精燈、培養(yǎng)皿、量筒。

主要試劑：氯化鈉（分析純）、石油醚（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）。

LB液體培養(yǎng)基：根據(jù)高中生物選修一課本中的操作步驟，制備培養(yǎng)大腸桿菌的常用培養(yǎng)基。配方為：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉10g，蒸餾水975 mL。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15g，蒸餾水960mL。將配制好的LB培養(yǎng)基放入立式壓力蒸汽滅菌鍋內(nèi)，溫度設(shè)置為121°C，時間設(shè)置為20min進行濕熱滅菌，滅菌后將LB培養(yǎng)基保存在冰箱備用。

1.2實驗方法及步驟

1.2.1揮發(fā)油的提取

（1）碰碰香葉片的清洗：從生長旺盛的碰碰香植株上剪下一串碰碰香葉片放入燒杯中，加入蒸餾水清洗干凈，用無菌吸水紙擦干其葉片表面的水分。

（2）碰碰香葉片的干燥：將洗凈后的碰碰香葉片用剪刀剪成碎片，然后置于小燒杯中，放入電熱鼓風干燥箱內(nèi)進行烘干，溫度設(shè)置為35℃，時間為40min。烘干后的碰碰葉片置于小燒杯中備用。

（3）水蒸餾法提取碰碰香揮發(fā)油：水蒸汽蒸餾法（SD）是一種將植物和水共同蒸餾，使揮發(fā)油與水蒸氣一起被蒸餾出的的提取方法，其所用溶劑是水，對人體無害，簡便安全，是大部分精油的提取方法。

將烘干后的碰碰香葉片裝入加有30mL蒸餾水的圓底蒸餾燒瓶，設(shè)置水浴鍋的溫度為70°C，打開真空泵的開關(guān)及排氣閥，放入蒸餾燒瓶，關(guān)閉排氣閥。再打開旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將轉(zhuǎn)速調(diào)到50rmp/min，對碰碰香葉片進行蒸餾。等到圓底蒸餾燒瓶中水分快被蒸干，僅剩烘干的碰碰香葉片時，關(guān)閉排氣閥以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的開關(guān)，取下圓底蒸餾燒瓶，繼續(xù)向里面加入30mL的蒸餾水，再次放入水浴鍋內(nèi)進行蒸餾，至獲得乳白色液狀的蒸餾初產(chǎn)物。

將蒸餾初產(chǎn)物與石油醚一同放入分液漏斗中進行萃取，關(guān)緊活塞并蓋上分液漏斗的蓋子，用力振蕩后，靜置40min。待分液漏斗內(nèi)的液體分層后，打開分液漏斗的活塞，將下層的液體混合物倒入燒杯中。再將燒杯中的液體混合物倒入蒸餾燒瓶內(nèi)，打開旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的開關(guān)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將混合物進行多次旋蒸，溫度設(shè)置為40℃，時間為1h。

1.2.2碰碰香揮發(fā)油抑菌活性研究

（1）固體培養(yǎng)基的制備：取滅菌后的LB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿置于超凈工作臺中，在酒精燈火焰附近進行倒平板操作，倒完平板后將培養(yǎng)皿靜置，待其冷卻后存放在超凈工作臺中，備用。

（2）菌種的純化：從冰箱中取出金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種，在超凈工作臺中將供試菌種用接種環(huán)接種到己滅菌的培養(yǎng)基中。將接種后的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，溫度為37℃，時間為24h。

（3）菌懸液的制備：用接種環(huán)挑取3～4環(huán)金黃色葡萄球菌放入盛有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶（250mL）中，后放置全溫度大容量振蕩培養(yǎng)箱37°C，叵溫振蕩培養(yǎng)24h。大腸桿菌的菌懸液制備操作同上。

（4）濾紙片的制備：采用K-B法（Kirby-Bauertest），即濾紙片法，選用質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔機打成直徑5minx5mm的小圓片，滅菌后烘干。

（5）抑菌活性的測試：振蕩菌懸液，用移液槍取20uL的菌懸液加入培養(yǎng)基，用涂布棒將其均勻涂布在平板上，靜置。將濾紙片分別放入雙蒸水和揮發(fā)油中浸濕，設(shè)置1組浸于雙蒸水的濾紙片為對照組，3組浸于碰碰香揮發(fā)油的濾紙片為實驗組，靜置于超凈工作臺中晾干。于每個培養(yǎng)皿中放置4個濾紙片，并保持相互間隔一定距離，培養(yǎng)皿37℃倒置培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)皿中抑菌圈的生長情況，游標卡尺測定抑菌圈的直徑，單位為mm。

2實驗結(jié)果及分析

2.1揮發(fā)油提取結(jié)果

采用水蒸汽蒸餾法提取所獲得的碰碰香揮發(fā)油為淺黃色油狀物。該產(chǎn)物具有香味，容易揮發(fā)，且有一定的折光性。由于實驗原材料較少，故提取出的揮發(fā)油量也十分少，只有0.85g。

產(chǎn)物用無水硫酸鈉干燥后放于陰涼處保存。

本次探究實驗采取水蒸氣蒸餾法提取碰碰香揮發(fā)油，既以水為溶劑，安全無害，又使用操作方便、提取效率高的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，同時對比傳統(tǒng)的水蒸餾裝置采用酒精燈加熱，溫度不易控制。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀初次蒸餾后所得為乳白色、具有黏稠性的液態(tài)初產(chǎn)物，再次萃取、蒸餾后得到淺黃色油狀終產(chǎn)物。鑒于精油易揮發(fā)，且本次提取量很少，及時密封保存。

2.2碰碰香揮發(fā)油對大腸桿菌的抑制作用

抑菌圈測量是對微生物進行分析的經(jīng)典方法，將含有揮發(fā)油的紙片貼在接種測試菌的瓊脂平板上，其少量水分使揮發(fā)油自濾紙片上溶解，并因其表面濕潤而擴散，揮發(fā)油向逐漸擴散形成遞減的梯度濃度，而在抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的直徑大小反映測試菌對揮發(fā)油的敏感程度，抑菌圈直徑的增大表明揮發(fā)油對該測試菌的抑制效果增強。本實驗的結(jié)果見表1。

實驗結(jié)果表明，碰碰香揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichia coli）均有抑菌效果。比較抑菌圈的直徑大小，碰碰香揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性大于大腸桿菌。

碰碰香揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比對大腸桿菌的明顯，與此前研究的結(jié)果革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對精油更為敏感一致。此外，在實驗過程中，嚴格遵守無菌操作規(guī)范，避免雜菌污染，否則會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

3總結(jié)與展望

首先，初次進行探究實驗時嘗試傳統(tǒng)的裝置提取碰碰香揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)難以控制溫度，且揮發(fā)油提取時間較長。改進實驗后，選用工作溫度恒定的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，操作方便，是更為理想的提取碰碰香揮發(fā)油裝置。其次，由于萃取操作中使用石油醚，盡管后續(xù)步驟進行了旋蒸，但提取到的碰碰香揮發(fā)油中仍可能帶有少量石油醚，可能對抑菌實驗有所影響，這是本實驗中所存在的不足之處。再次，本實驗雖然將碰碰香的揮發(fā)油提取出來，但并未對碰碰香揮發(fā)油的成分進行具體分析，后續(xù)研究可以進一步對碰碰香揮發(fā)油的化學(xué)成分進行分離，再探究其中的有效抑菌成分及抑菌機理。最后，觀察發(fā)現(xiàn)碰碰香揮發(fā)油對兩種供試菌種的抑菌圈都比較大，并且清晰可見，可以與抗生素如阿莫西林、青霉素等進行抑菌活性的對比，為碰碰香揮發(fā)油抑菌活性的探究提供進一步的參考。