陳欣寧 趙亮 范里 劉旭平 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

抗體類(lèi)藥物是近年來(lái)研發(fā)數(shù)量最多、銷(xiāo)售增長(zhǎng)速度最快的治療性重組蛋白藥物，它具有靶向明確、安全性高和循環(huán)半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已被批準(zhǔn)用于癌癥、免疫性疾病、病毒感染等多種疾病的治療［1］。抗體類(lèi)藥物生產(chǎn)用最主要的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞，這是因?yàn)橛蒀HO細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白具有與人體血清蛋白高度相似的糖鏈結(jié)構(gòu)［2］。而抗體類(lèi)藥物的糖鏈結(jié)構(gòu)（如唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖比例等）與蛋白分子的電荷分布、穩(wěn)定性和溶解性等理化性質(zhì)以及藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)活性等體內(nèi)藥效密切相關(guān)［3-4］，因此糖基化是抗體類(lèi)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。隨著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)水平明顯提高。目前在優(yōu)化的CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過(guò)程中，最高活細(xì)胞密度和產(chǎn)物表達(dá)量分別能達(dá)到1-2×107cells/ml和g/L級(jí)［5］。然而在產(chǎn)物大量合成的高密度細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)環(huán)境更為復(fù)雜，較易發(fā)生過(guò)程參數(shù)滲透壓和二氧化碳分壓累積以及代謝副產(chǎn)物氨的濃度升高的情況，會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與維持和產(chǎn)物表達(dá)與糖基化過(guò)程產(chǎn)生不利影響［6-8］。

氨是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的主要代謝副產(chǎn)物之一，它主要是由細(xì)胞代謝谷氨酰胺和天冬酰胺生成，少部分是谷氨酰胺自發(fā)降解產(chǎn)生［9］。在高密度細(xì)胞流加培養(yǎng)過(guò)程中氨的濃度往往不斷升高，細(xì)胞維持期（產(chǎn)物表達(dá)期）的氨濃度通常達(dá)到6-10 mmol/L［5，10］， 有 些 培 養(yǎng) 過(guò) 程 中 甚 至 超 過(guò)10 mmol/L［11］。高濃度的氨通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入胞漿以及線(xiàn)粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，導(dǎo)致胞漿和這些細(xì)胞器內(nèi)的pH升高，進(jìn)而影響了正常的胞內(nèi)生化反應(yīng)，如物質(zhì)和能量代謝、糖鏈加工、蛋白質(zhì)翻譯等［9，12］。研究表明，在初始培養(yǎng)時(shí)提高氨的濃度會(huì)影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程［13-15］，由于在初始培養(yǎng)時(shí)提高氨的濃度會(huì)同時(shí)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝水平，而產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程與培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝水平密切相關(guān)［16-17］，導(dǎo)致在這些研究中氨本身對(duì)產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程的影響更為復(fù)雜?？紤]到在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)期的氨濃度和產(chǎn)物表達(dá)量較低，而在產(chǎn)物大量合成的細(xì)胞維持期氨濃度較高。因此，細(xì)胞維持期氨對(duì)產(chǎn)物的表達(dá)和糖鏈結(jié)構(gòu)的影響更應(yīng)該被關(guān)注。

為此，本研究考察了在表達(dá)抗體融合蛋白的CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過(guò)程中，不同的氨濃度在細(xì)胞維持期對(duì)細(xì)胞維持與代謝、抗體融合蛋白表達(dá)以及N-糖基化的作用，認(rèn)識(shí)氨濃度升高對(duì)抗體融合蛋白的表達(dá)和N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響，從而對(duì)表達(dá)抗體類(lèi)藥物以及其它治療性重組蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)發(fā)與控制奠定部分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的細(xì)胞為表達(dá)抗體融合蛋白的重組CHO細(xì)胞株。種子細(xì)胞傳代培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，為本實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)的無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基［18］。流加培養(yǎng)基為葡萄糖和氨基酸的濃縮液。用于配制培養(yǎng)基的所有試劑和原料均從Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(mǎi)。配制完的培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm濾膜（Millipore）過(guò)濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 種子細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的CHO種子細(xì)胞，加入至含有10 mL種子傳代培養(yǎng)基的離心管中，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)上清。用適量種子傳代培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，控制活細(xì)胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至125 mL搖瓶中（美國(guó)Corning公司），置于培養(yǎng)箱中的搖床上（杭州奧盛儀器有限公司）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行傳代，控制傳代后種子細(xì)胞的活細(xì)胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。

1.2.2 流加培養(yǎng) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)上清，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，控制活細(xì)胞密度為1.0×106cells/mL，接種體積為80 mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至250 mL搖瓶中（美國(guó)Corning公司），置于培養(yǎng)箱中的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天添加3%（V/V）的流加培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至最大活細(xì)胞密度時(shí)（培養(yǎng)第5天），一次性添加不同濃度的氯化銨濃縮液，分別使培養(yǎng)液中的氨濃度升高0（不添加）、2、4和6 mmol/L后繼續(xù)培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每天取樣1 mL進(jìn)行細(xì)胞密度和活率檢測(cè)，培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于主要代謝物和副產(chǎn)物濃度、抗體融合蛋白表達(dá)量和純化后的糖基化檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞密度和活率檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)液用磷酸緩沖液和0.4%（W/V）臺(tái)盼藍(lán)染色液稀釋后，加到血球計(jì)數(shù)板中計(jì)錄活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比即為活率。同時(shí)采用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Dead Cell Apoptosis Kit（美國(guó)Thermo Fisher公司）對(duì)凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)。首先取細(xì)胞1.0×106cells/mL，離心除去培養(yǎng)液并用PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞沉淀重懸于100 μL 1×Annexin binding buffer中，檢測(cè)樣本添加1 μL PI溶液和 5 μl Annexin V-FITC 溶液，同時(shí)設(shè)置不添加PI和Annexin V-FITC溶液的檢測(cè)對(duì)照組，室溫避光放置15 min后加入400 μL 1×Annexin binding buffer并充分混勻。采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)結(jié)果，用Flowjo軟件（美國(guó)BD公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 主要代謝物和副產(chǎn)物濃度檢測(cè) 培養(yǎng)上清中的主要代謝物葡萄糖和谷氨酰胺、代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的濃度采用生化分析儀Nova BioProfile 400（Nova Biomedical）測(cè)定。

1.2.6 抗體融合蛋白表達(dá)量檢測(cè) 培養(yǎng)上清中抗體融合蛋白的表達(dá)量采用尺寸排阻色譜的方法進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為G3000SWXL，7.8×300 mm（TOSOH）。具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)［19］。

1.2.7 抗體融合蛋白純化 抗體融合蛋白的純化采用Protein A親和層析的方法，純化柱為Mab Select SuRe（GE Healthcare）。具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)［19］。

1.2.8 抗體融合蛋白唾液酸含量檢測(cè) 按照2015年版《中國(guó)藥典》（三部）中間苯二酚顯色法檢測(cè)抗體融合蛋白的唾液酸含量。

1.2.9 抗體融合蛋白N-糖鏈結(jié)構(gòu)檢測(cè) 抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)采用2-對(duì)氨基苯甲酰胺標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)［20］。首先用糖苷酶PNGase F（New England BioLabs）將N端糖鏈從抗體融合蛋白上切除，隨后加入-20℃的乙醇，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，置于真空離心濃縮儀（Thermo）中揮發(fā)溶液。然后使用2-對(duì)氨基苯甲酰胺熒光標(biāo)記物（Prozyme）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求與糖鏈反應(yīng)，最后通過(guò)TSKGEL Amide-80，4.6×250 mm（TOSOH）色譜柱檢測(cè)樣品的N-糖鏈結(jié)構(gòu)，流動(dòng)相A為50 mmol/L 甲酸銨（pH4.4），流動(dòng)相B為乙腈，梯度條件為在140 min內(nèi)由30%-55%流動(dòng)相A 的線(xiàn)性梯度洗脫，流速為0.4 mL/min。檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器（Waters），激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm。

圖1 抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)譜圖

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 抗體融合蛋白的比生成速率qp（pg/cell/day）的計(jì)算公式如下：

其中Titer為抗體抗體融合蛋白的表達(dá)量（mg/L）；IVCC（Integrated viable cell concentraion）為活細(xì)胞密度對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的積分（109cells·day/L）。

培養(yǎng)上清中主要代謝物和副產(chǎn)物的比生成/消耗速率qm（pmol/cell/day）的計(jì)算公式如下：

其中Concentration為代謝物或副產(chǎn)物的濃度（mmol/L）。

抗體融合蛋白的唾液酸化（Sialylation）、半乳糖化（Galactosylation）、巖藻糖化（Fuosylation）程度的計(jì)算公式如下：

Sialylation=［0.5×（A1+A1F）+A2+A2F］×100%

Galactosylation=［0.5×（G1+G1F）+G2+G2F+A1+A1F+A2+A2F］×100%

Fucosylation=（G0F+G1F+G2F+A1F+A2F）×100%

其中抗體融合蛋白的G0、G2、A2F等糖鏈的具體結(jié)構(gòu)參考圖1。

2 結(jié)果

2.1 氨濃度升高對(duì)CHO細(xì)胞維持以及抗體融合蛋白表達(dá)的影響

為了排除維持期細(xì)胞密度對(duì)抗體融合蛋白的表達(dá)以及N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最高活細(xì)胞密度時(shí)（培養(yǎng)第5天），往培養(yǎng)液中一次性加入不同濃度的氯化銨濃縮液使氨濃度分別上升0（對(duì)照組）、2、4和6 mmol/L，以營(yíng)造只有氨濃度不同的細(xì)胞維持期培養(yǎng)環(huán)境。同時(shí)，為了避免因細(xì)胞后期死亡而釋放至培養(yǎng)液的宿主蛋白酶和糖苷酶對(duì)抗體融合蛋白及其糖鏈的降解，在培養(yǎng)第11天時(shí)（細(xì)胞活率＞90%）結(jié)束培養(yǎng)。

圖2 不同氨濃度條件下的CHO細(xì)胞維持（A）、細(xì)胞活率（B）、抗體融合蛋白表達(dá)（C）及氨濃度（D）情況

圖2是不同氨濃度條件下的CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活率、抗體融合蛋白表達(dá)以及維持期氨濃度的情況。首先由圖2-A可知，培養(yǎng)前期細(xì)胞快速生長(zhǎng)，至培養(yǎng)第5天時(shí)達(dá)到最高活細(xì)胞密度為（7.88±0.32）×106cells/mL。此后細(xì)胞進(jìn)入維持期，培養(yǎng)第5-9天活細(xì)胞密度不變。培養(yǎng)第9天以后活細(xì)胞密度開(kāi)始緩慢下降，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的活細(xì)胞密度為（7.02±0.11）×106cells/mL。由圖2-B可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)期以及維持期的前3天（培養(yǎng)第0-8天），細(xì)胞活率較高（＞98%）。培養(yǎng)第8天以后細(xì)胞活率開(kāi)始緩慢下降，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的細(xì)胞活率為90.96±0.95%。盡管通過(guò)氯化銨的添加使細(xì)胞維持期的氨濃度分別升高了2、4和6 mmol/L，氨濃度最高達(dá)到 12.08±0.28 mmol/L（圖2-D），但培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率與對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著差別。由此可見(jiàn)，細(xì)胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對(duì)細(xì)胞維持和最終活率沒(méi)有影響，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)4個(gè)條件下的細(xì)胞活率均大于90%。

圖3是不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，由圖可知，4組條件下細(xì)胞形態(tài)較為接近。表1總結(jié)了培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的平均細(xì)胞直徑，由表可知，4組條件下均沒(méi)有顯著差異，可見(jiàn)維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞大小沒(méi)有影響。此外，本研究進(jìn)一步分析了培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的凋亡細(xì)胞比例，圖4為不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)凋亡細(xì)胞比例的流式檢測(cè)圖，圖譜的右上方和右下方分別為晚期凋亡和早期凋亡的細(xì)胞及其占總細(xì)胞的比例，由圖可知，4組條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的晚期凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞分布較為接近，總凋亡比例較低（＜3%）。經(jīng)計(jì)算，4組條件下的凋亡細(xì)胞比例沒(méi)有顯著差異（表1），可見(jiàn)維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞凋亡也沒(méi)有影響。

圖3 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞形態(tài)（白圈標(biāo)記為死細(xì)胞）

表1 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的平均細(xì)胞直徑和凋亡比例

抗體融合蛋白表達(dá)方面，由圖2C可知在細(xì)胞生長(zhǎng)期，抗體融合蛋白的表達(dá)量只有130.50±23.35 mg/L。進(jìn)入細(xì)胞維持期后，抗體融合蛋白開(kāi)始大量表達(dá)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)對(duì)照組抗體融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到1 152.31±22.23 mg/L。其中細(xì)胞維持期抗體融合蛋白的表達(dá)量為1 021.81±22.67 mg/L，占培養(yǎng)過(guò)程中總表達(dá)量的比例高達(dá)88.67%，因此這一培養(yǎng)階段也稱(chēng)為產(chǎn)物表達(dá)期。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)氨濃度升高2 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達(dá)量不變，而升高4和6 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達(dá)量分別只有對(duì)照組的 90.22%（P＜0.05）和 82.65%（P＜0.05）?？梢?jiàn)隨著氨濃度的升高（＞9 mmol/L），抗體融合蛋白的表達(dá)量逐漸降低。由于培養(yǎng)過(guò)程的最終產(chǎn)物表達(dá)量是IVCC和產(chǎn)物比生成速率的乘積，而4個(gè)條件下的IVCC沒(méi)有差異（表2），因此抗體融合蛋白表達(dá)量的降低是比生成速率的減少導(dǎo)致的。經(jīng)計(jì)算，在氨濃度升高4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的比生成速率比對(duì)照組顯著減少了9.88%和17.72%（P＜0.05）。

圖4 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)凋亡細(xì)胞比例的流式檢測(cè)圖

表2 不同氨濃度條件下的IVCC和抗體融合蛋白的比生成速率

以上結(jié)果表明，細(xì)胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)CHO細(xì)胞的維持、培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞活率、形態(tài)以及凋亡比例沒(méi)有影響，但當(dāng)氨濃度超過(guò)9 mmol/L時(shí)，抗體融合蛋白的表達(dá)能力開(kāi)始下降。

2.2 氨濃度升高對(duì)CHO細(xì)胞代謝的影響

圖5是不同氨濃度條件下細(xì)胞維持期主要營(yíng)養(yǎng)物葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及主要代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的累積情況。由圖5-A可知，細(xì)胞維持期對(duì)照組的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率分別為0.66±0.03 pmol/cell/day 和 0.10±0.01 pmol/cell/day，其它3組氨濃度升高條件下的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。

乳酸是葡萄糖代謝的主要副產(chǎn)物。由圖5-B可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)期（培養(yǎng)0-5 d），乳酸濃度累積至24.21±0.60 mmol/L。細(xì)胞維持期細(xì)胞繼續(xù)分泌乳酸，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)對(duì)照組的乳酸濃度達(dá)到29.34±0.41 mmol/L，共生成了5.13±0.86 mmol/L（圖5-C），這一階段的乳酸比生成速率為0.11±0.02 pmol/cell/day（圖5-D）。氨是細(xì)胞消耗谷氨酰胺所產(chǎn)生的主要代謝副產(chǎn)物，由圖2-D可知，細(xì)胞維持期氨持續(xù)生成，對(duì)照組的氨生成量為1.70±0.18 mmol/L（圖5-C），這一階段的氨比生成速率為0.036±0.004 pmol/cell/day（圖5-D）。與對(duì)照組相比，其它3組氨濃度升高條件下無(wú)論是乳酸和氨的總生成量，還是兩者的比生成速率均沒(méi)有顯著變化。

以上結(jié)果表明，細(xì)胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對(duì)CHO細(xì)胞的葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成均沒(méi)有產(chǎn)生影響。

2.3 氨濃度升高對(duì)抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)以及唾液酸含量的影響

糖基化是抗體類(lèi)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，糖基化的有效控制與最終藥物的臨床安全性和有效性密切相關(guān)。圖6為不同氨濃度下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的4種主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)（唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖）的比例。唾液酸（Sialic acid）位于N-糖鏈的末端，唾液酸化比例是指N-糖鏈中所有含唾液酸的糖鏈所占的比例（圖1）。由圖6-A可知，氨濃度升高導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的唾液酸化比例顯著降低。其中，氨濃度僅升高2 mmol/L就能導(dǎo)致唾液酸化比例從15.49±1.21%顯著降低到12.30±0.65%（P＜0.05），且隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的唾液酸化比例會(huì)繼續(xù)降低。

半乳糖化比例是指N-糖鏈中所有含半乳糖（Galactose）的糖鏈所占的比例（圖1）。由于半乳糖的連接是唾液酸加工至N-糖鏈上的前提，半乳糖化程度會(huì)直接影響最終N-糖鏈的唾液酸化程度。由圖6-B可知，對(duì)照組培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的半乳糖化比例為51.41±0.67%，在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的半乳糖化比例分別只有46.50±1.15%、42.59±0.85%和41.04±0.41%?？梢?jiàn)隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化比例也在不斷降低。

巖藻糖化比例是指N-糖鏈中所有含巖藻糖（Fucose）的糖鏈所占的比例（圖1）。高甘露糖是N-糖基化過(guò)程早期形成的末端含有多個(gè)甘露糖（Mannose）的不完整糖型，在圖1所示的抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)中，高甘露糖比例特指Man5糖型的比例。由圖6-C可知，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的大部分N-糖鏈（＞70%）含有巖藻糖，氨濃度升高對(duì)巖藻糖化比例沒(méi)有明顯影響。而圖6-D顯示，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的Man5比例較低（＜3%），氨濃度升高條件下Man5比例沒(méi)有發(fā)生改變。

圖5 不同氨濃度條件下細(xì)胞維持期的葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率（A）、乳酸濃度（B）、乳酸和氨的生成（C）以及乳酸和氨的比生成速率（D）情況

抗體融合蛋白的唾液酸含量是指導(dǎo)最終產(chǎn)品放行的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之一。圖7為不同氨濃度下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的唾液酸含量。可以看出，隨著氨濃度的升高，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的唾液酸含量不斷降低。在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的唾液酸含量分別只有對(duì)照組的92.06%，86.64%和83.97%。氨濃度的升高量與最終抗體融合蛋白的唾液酸含量具有較好的負(fù)相關(guān)性（R2=0.953 6）。

3 討論

運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)抗體類(lèi)藥物已成為當(dāng)今生物制藥行業(yè)的主流趨勢(shì)。隨著細(xì)胞株構(gòu)建、培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)以及過(guò)程優(yōu)化技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)水平明顯提高，同時(shí)培養(yǎng)環(huán)境也更為復(fù)雜。其中代謝副產(chǎn)物氨的累積會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝、產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程受到影響［13-15］。由于細(xì)胞密度和代謝水平的不同也會(huì)影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程［16-17］，因此本研究系統(tǒng)考察了在培養(yǎng)前期細(xì)胞密度和代謝水平相同的條件下，氨濃度升高對(duì)細(xì)胞維持期CHO細(xì)胞維持、細(xì)胞代謝、抗體融合蛋白的表達(dá)以及N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響。

細(xì)胞的諸多生理代謝反應(yīng)如糖酵解和磷酸戊糖途徑在胞漿進(jìn)行，氨能通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞，使胞漿pH異常升高，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝反應(yīng)受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理狀態(tài)［9，14］。研究表明，在初始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)提高氨濃度至超過(guò)5 mmol/L后，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和最高活細(xì)胞密度減少［13，21］。由于在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中氨是持續(xù)生成的，培養(yǎng)前期的氨濃度往往較低，而在產(chǎn)物大量合成的細(xì)胞維持期氨濃度才會(huì)較高。因此，細(xì)胞維持期氨對(duì)過(guò)程結(jié)果的影響更應(yīng)該被關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)CHO細(xì)胞的維持、培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞活率、形態(tài)以及凋亡比例沒(méi)有影響?？梢?jiàn)氨對(duì)不同培養(yǎng)階段細(xì)胞的影響是不同的。

圖6 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的唾液酸化比例（A）、半乳糖化比例（B）、巖藻糖化比例（C）以及高甘露糖比例（D）

圖7 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體融合蛋白的唾液酸含量

產(chǎn)物的最終表達(dá)量是IVCC和產(chǎn)物比生成速率共同決定的［22］。在維持細(xì)胞密度相同的情況下，細(xì)胞的最終活率將直接影響IVCC。此外，細(xì)胞需要消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺為產(chǎn)物合成提供能量［23］。因此在維持細(xì)胞密度相同的條件下，抗體融合蛋白的最終表達(dá)量與細(xì)胞的維持情況和代謝水平密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞維持期氨濃度維持在5-12 mmol/L時(shí)，雖然CHO細(xì)胞的維持情況、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產(chǎn)物乳酸和氨的生成沒(méi)有受到影響，但當(dāng)氨濃度超過(guò)9 mmol/L時(shí)，抗體融合蛋白的比生成速率顯著減少，導(dǎo)致最終表達(dá)量顯著降低。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道［13，15］，當(dāng)氨濃度超過(guò)10 mmol/L后，最終產(chǎn)物的表達(dá)量降低。由于這些研究是在初始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)提高氨的濃度，對(duì)培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長(zhǎng)也造成影響，導(dǎo)致IVCC下降。在本研究中，相同的IVCC更能體現(xiàn)氨對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物能力的負(fù)作用。

抗體類(lèi)藥物的唾液酸化程度、高甘露糖糖型比例、半乳糖化程度和巖藻糖化程度分別與藥物的循環(huán)半衰期、補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性（Complementdependent cytotoxicity，CDC）和抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性（Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC） 等臨床表現(xiàn)相關(guān)［24］。產(chǎn)物的糖基化過(guò)程控制是生物制藥界面臨的難題之一。研究表明，氨能通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入高爾基體，擾亂其正常的pH環(huán)境，使重要的功能酶（如糖基轉(zhuǎn)移酶）的作用受到影響，最終導(dǎo)致產(chǎn)物的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［12，25］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞維持期氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度均不斷降低，而巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例則沒(méi)有發(fā)生變化，明確了氨影響糖基化過(guò)程的作用位點(diǎn)。與蛋白表達(dá)過(guò)程相比，糖基化過(guò)程對(duì)氨更為敏感，氨濃度超過(guò)5 mmol/L就能導(dǎo)致抗體融合蛋白的糖基化過(guò)程受到影響。此外，Yang等［13］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨濃度超過(guò)5 mmol/L后，最終產(chǎn)物的糖基化程度降低。Hoog等［21］同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨濃度超過(guò)5 mmol/L后，最終產(chǎn)物的半乳糖化程度降低，但其它糖鏈結(jié)構(gòu)的比例則沒(méi)有變化。然而，這些研究仍是在初始培養(yǎng)時(shí)提高氨的濃度，導(dǎo)致培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的消耗以及代謝副產(chǎn)物的生成情況改變，而細(xì)胞密度以及代謝水平的差異也可能會(huì)影響糖基化加工。在本研究中，由于實(shí)驗(yàn)排除了維持細(xì)胞密度和細(xì)胞代謝水平對(duì)糖基化過(guò)程的影響，結(jié)果更直觀地體現(xiàn)了氨對(duì)糖基化過(guò)程的作用。

產(chǎn)物的高效表達(dá)是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程建立的首要目標(biāo)。而糖基化是抗體類(lèi)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求對(duì)抗體類(lèi)藥物的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行嚴(yán)密的控制［2］。氨作為高密度細(xì)胞流加培養(yǎng)過(guò)程中累積的主要代謝副產(chǎn)物之一，會(huì)直接影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程。因此，正確認(rèn)識(shí)氨對(duì)產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過(guò)程的作用，同時(shí)結(jié)合藥物的作用機(jī)制和具體的糖基化控制要求設(shè)定合理的氨濃度控制區(qū)間，對(duì)運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by design，QbD）方法建立高效的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程及其后續(xù)的過(guò)程放大策略具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究考察了細(xì)胞維持期氨濃度升高對(duì)CHO細(xì)胞維持、細(xì)胞代謝、抗體融合蛋白表達(dá)和N-糖基化的影響。結(jié)果表明，氨濃度升高（5-12 mmol/L）對(duì)CHO細(xì)胞的維持、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產(chǎn)物乳酸和氨的生成情況沒(méi)有明顯影響，但不利于抗體融合蛋白的表達(dá)和N-糖基化過(guò)程。氨濃度大于5 mmol/L即可對(duì)抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度產(chǎn)生不利影響，但氨濃度升高對(duì)巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例沒(méi)有作用。而當(dāng)氨濃度升高至大于9 mmol/L后，抗體融合蛋白的比生成速率開(kāi)始顯著減少，導(dǎo)致最終表達(dá)量顯著降低。