柯樹煒 呂金慧 陳萍 張榮萍 俞悅

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228）

植物內(nèi)生真菌是一類定殖于宿主植物體內(nèi)的特殊微生物類群。自1993年Stierle等［1］從紅豆杉中分離得到了一株產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌安德魯紫杉菌（Taxomyces andrena）后，關(guān)于利用植物內(nèi)生真菌來(lái)獲得天然活性物質(zhì)的研究就成為了近年來(lái)的熱點(diǎn)。研究表明植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中天然活性成分非常豐富，不僅能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)，還能夠通過(guò)自身的代謝體系產(chǎn)生新的活性成分，已知結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)新穎的化合物均有報(bào)道［2］。番木瓜是著名的熱帶、亞熱帶果樹之一。含有生物堿、萜類化合物、黃酮類化合物等多種生物活性成分，研究表明其具有良好的生物活性［3-4］。但國(guó)內(nèi)外對(duì)番木瓜內(nèi)生真菌的研究仍然較少，本次實(shí)驗(yàn)從番木瓜植株的莖、葉、果等各部位分離內(nèi)生真菌。通過(guò)對(duì)其菌株的次生代謝產(chǎn)物成分進(jìn)行初步分析，篩選其中具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的菌株，并通過(guò)觀察PDA平板上菌落和分生孢子的形態(tài)以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析等手段對(duì)菌種進(jìn)行了鑒定。本研究將為開發(fā)植物內(nèi)生真菌這一微生物資源和利用發(fā)酵法生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑 番木瓜采樣地點(diǎn)位于海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科基地，隨機(jī)采集不同番木瓜植株的葉片、枝條、果實(shí)。甲醇、乙醇、NaClO、乙酸乙酯、NaOH、FeCl3、硼酸、Al（NO3）3、NaNO2等均為分析純級(jí)試劑。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用于分離和純化，馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）用于菌株搖瓶發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 番木瓜植株各部位內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的植物內(nèi)生菌組織分離法［5］。略作修改后具體做法如下：將從番木瓜植株上采集帶回的無(wú)明顯病斑葉片、枝條、果實(shí)用流水沖洗。用無(wú)菌刀片將上述番木瓜植株樣品切分成適當(dāng)大小的組織塊，首先用75%乙醇處理組織塊75 s、之后用2.6% NaClO溶液浸泡處理組織塊150 s，最后用無(wú)菌水沖洗3-5次進(jìn)行表面消毒。將處理好后的樣品用無(wú)菌刀片除去暴露在外界環(huán)境中的表皮部分，切成0.5 cm × 0.5 cm組織塊。移入PDA培養(yǎng)基（含氯霉素）進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中呈品字形放置3個(gè)組織塊。28℃培養(yǎng)5-7 d，觀察并記錄組織塊的出菌狀況，及時(shí)轉(zhuǎn)移并純化菌株。

1.2.2 菌株發(fā)酵與供試樣品的制備 選取于PDA平板上長(zhǎng)勢(shì)良好且單一的菌株，利用直徑大小約為6 mm的打孔器在平板上打孔，將3-5個(gè)菌餅接種于滅菌冷卻后的PDB肉湯中。500 mL錐形瓶中加入250 mL PDB肉湯，封口膜扎緊，在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置溫度28℃、轉(zhuǎn)速130 r/min搖瓶發(fā)酵10 d。菌株發(fā)酵10 d之后，真空抽濾，分別得發(fā)酵液和菌絲體兩部分。發(fā)酵液利用等體積乙酸乙酯萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃將萃取液回收濃縮至原體積的1/10。過(guò)濾所得菌絲體在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)55℃烘干后研磨成粉，菌絲體和乙酸乙酯質(zhì)量體積比（W/V）為1：20料液比萃取，超聲處理1 h，過(guò)濾除去不溶物，減壓回收濃縮。將上述發(fā)酵液和菌絲體兩部分的濃縮萃取液合并，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，即得菌株的次生代謝產(chǎn)物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品的顯色反應(yīng)檢測(cè)［6-7］硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)檢測(cè)：將樣品液定點(diǎn)滴加于濾紙上，稍干之后反復(fù)滴加3次，濃縮樣品。將10%Al（NO3）3（W/V）溶液和NaNO2（W/V）溶液1：1混合滴加于樣品位置。揮干后濾紙片立即于紫外燈下檢視，觀察是否有熒光斑點(diǎn)或熒光環(huán)出現(xiàn)。

氫氧化鈉溶液反應(yīng)檢測(cè)：將1.0 mL樣品液置于試管中，加入4%（W/V）的NaOH溶液0.2 mL，觀察是否有黃色或黃褐色現(xiàn)象出現(xiàn)。

乙酸鎂甲醇溶液反應(yīng)檢測(cè)：將 1.0 mL樣品液置于試管中，加入1%（W/V）的乙酸鎂甲醇溶液0.25 mL，觀察是否有黃色出現(xiàn)。

三氯化鐵溶液檢測(cè)：1.0 mL樣品液置于試管中，加入0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%（W/V）的FeCl3溶液，充分混合，觀察是否有墨綠色至紫黑色現(xiàn)象出現(xiàn)。

硼酸反應(yīng)：將1.0 mL樣品液置于試管中，加入2%（W/V）的硼酸溶液0.25 mL，觀察溶液是否有黃色出現(xiàn)。

1.2.4 薄層色譜法（TLC）以氯仿∶甲醇∶甲酸=15∶5∶1（V/V）為展開劑，在距離硅膠板一端0.4 cm處用鉛筆劃線，作為點(diǎn)樣起始線的標(biāo)記。用毛細(xì)管將顯色反應(yīng)篩選所得陽(yáng)性樣品點(diǎn)于硅膠板展開，以0.5 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。當(dāng)溶劑前沿達(dá)到硅膠板另一端0.2-0.3 cm時(shí)取出。使用3%（W/V）AlCl3甲醇溶液作為顯色劑，硅膠板取出揮干后噴霧顯色，365 nm紫外燈檢查和記錄。

1.2.5 紫外吸收光譜檢測(cè) 以甲醇溶液為空白對(duì)照，將次生代謝產(chǎn)物樣品用甲醇定容并稀釋至適宜濃度，在220-420 nm之間進(jìn)行光譜掃描，尋找樣品溶液最大吸收峰所在波長(zhǎng)。檢測(cè)其是否符合黃酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征［8］。

1.2.6 總黃酮含量的測(cè)定［9］菌株次生代謝產(chǎn)物中總黃酮含量的測(cè)量參照硝酸鋁顯色法，具體做法如下：分別吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL蘆丁溶液1.0 mL至于10 mL試管中，加入5%NaNO2（W/V）溶液0.4 mL混勻，放置6 min；加入Al（NO3）3（W/V）溶液 0.4 mL，放置 6 min；加入 4%（W/V）NaOH溶液4.0 mL，充分混合后用甲醇定容至10 mL，靜置反應(yīng)15 min；在510 nm處測(cè)定吸光值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將發(fā)酵所得次生代謝產(chǎn)物配置為1 mg/mL的甲醇溶液作為供試樣品液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.7 菌株鑒定 通過(guò)菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，對(duì)經(jīng)顯色反應(yīng)篩選、TLC分析和UV分析后初步確定產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。內(nèi)生真菌菌株形態(tài)特征的觀察通過(guò)插片法［10］進(jìn)行制片，并利用棉藍(lán)染色液進(jìn)行染色，在Leica生物顯微鏡DM2000下放大400倍和1 000倍檢視菌株分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征。ITS序列分析利用試劑盒D2300提取菌株總DNA，并選用ITS1F正向（5'-CTTGGTCATTTAGAGAAGTAA-3'）和 ITS4反向（5'-TCCTCCGCTTAGATATGC-3'）作為擴(kuò)增引物。

PCR采用25.0 μL反應(yīng)體系，具體如下：2 ×PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L 的正反引物各 1.0 μL，內(nèi)生真菌菌株模板 DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，總計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送廣州華大基因服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得內(nèi)生真菌的ITS序列通過(guò)BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性序列檢索比對(duì)，若序列相似性大于99%，可鑒定為相同種；介于95%-99%之間，可鑒定為相同屬；小于95%，可鑒定為相同科［11］，以此獲得菌株分子鑒定結(jié)果。通過(guò)MEGA7.0軟件［12］，以鄰接法（Neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中bootstrap設(shè)置檢驗(yàn)值≥50%，共1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 顯色反應(yīng)初篩選

由于硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)是黃酮類物質(zhì)的特異顯色劑，可以使黃酮類物質(zhì)在紫外燈下顯熒光，而其他顯色劑可能因?yàn)殛?yáng)性反應(yīng)顏色變化較弱或樣品本身顏色較深不易觀察，因此本次實(shí)驗(yàn)中利用顯色反應(yīng)篩選產(chǎn)黃酮菌株的必要條件是硝酸鋁-亞硝酸鈉濾紙顯色反應(yīng)為陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)的初步分析，在分離所得的內(nèi)生真菌中，菌株編號(hào)為G41的樣品液對(duì)下表中所述5種顯色反應(yīng)均顯陽(yáng)性。初步判斷菌株G41可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)（表1）。

表1 顯色反應(yīng)結(jié)果

2.2 薄層層析結(jié)果分析

對(duì)初篩選得到的陽(yáng)性菌株進(jìn)行薄層層析，樣品在硅膠板上展開并顯色后。菌株G41的乙酸乙酯提取物顯示出與對(duì)照所用槲皮素具有相同Rf值的黃綠色熒光斑點(diǎn)。說(shuō)明其菌株的次生代謝產(chǎn)物中含有與槲皮素相同或相似的黃酮類化合物。其他菌株的乙酸乙酯提取物在展開顯色后雖然同樣能呈現(xiàn)黃綠色熒光斑點(diǎn)，但是與本次實(shí)驗(yàn)中所用對(duì)照遷移率不符，可能含有的是與槲皮素不同的其他黃酮類的物質(zhì)（圖 1）。

圖1 內(nèi)生真菌G41薄層層析圖

2.3 紫外光譜掃描結(jié)果分析

根據(jù)220-420 nm之間紫外光譜掃描的圖譜顯示，菌株G41的乙酸乙酯提取物在波長(zhǎng)220-420 nm間有2個(gè)較明顯的吸收峰，最大吸收峰分別在317 nm、254 nm處，這與黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在200-400 nm間存在2個(gè)主要吸收峰帶分別是300-400 nm峰帶I和220-280峰帶II的UV光譜特征相符合（圖2）。進(jìn)一步說(shuō)明該菌株G41的乙酸乙酯提取物中存在黃酮類成分。

圖2 菌株G41乙酸乙酯提取物在220-420 nm處的紫外光譜圖

2.4 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，以蘆丁為對(duì)照品所測(cè)回歸方程為y= 1.045 7x+ 0.004 6，R2= 0.997 6，回歸方程表明其在0.1-1.0 mg之間的線性關(guān)系良好，經(jīng)換算被測(cè)樣品菌株G41濃度為1 mg/mL的乙酸乙酯提取物中總黃酮類物質(zhì)含量為0.187 8 mg/mL。

圖3 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 菌株G41的形態(tài)與分子鑒定

番木瓜內(nèi)生真菌G41在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d后，平板劃線處分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，菌落正面呈現(xiàn)綠色或近灰綠色。菌絲有隔，分生孢子梗各頂端的小梗以掃帚狀的形式分支，產(chǎn)生球形或橢圓形的大量分生孢子。根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)［13］進(jìn)行比對(duì)，該內(nèi)生真菌菌株G41符合其中關(guān)于青霉屬菌株的形態(tài)特征描述。

該菌株測(cè)序所得ITS序列在NCBI上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，下載其中相似度最高的菌株序列以及相關(guān)種屬菌株的ITS序列數(shù)據(jù)并保存，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖4所示?；?4個(gè)菌株的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株G41與Penicillium citrinumMG659617.1和P.citrinumMH483870.1兩株橘青霉菌株聚在同一個(gè)分支（圖5）。通過(guò)ITS序列分析結(jié)合菌落和分生孢子形態(tài)特征，初步鑒定該內(nèi)生真菌G41為青霉屬橘青霉P. citrinum。

圖4 內(nèi)生真菌G41的平板菌落形態(tài)及其分生孢子形態(tài)（放

3 討論

圖5 基于 rDNA ITS 序列采用鄰接法構(gòu)建的番木瓜內(nèi)生真菌G41與相關(guān)種屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

近年來(lái)，針對(duì)植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究日益增多，特別是關(guān)于活性成分生產(chǎn)菌的篩選以及活性物質(zhì)的化學(xué)成分分析等方面［14］。其中，能夠產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌在多種不同宿主植物的內(nèi)生真菌中均有報(bào)道，并且發(fā)現(xiàn)該部分內(nèi)生真菌多分布于鐮胞霉屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillin）、交鏈孢屬（Alternaria）等多個(gè)種屬中［15-16］。周寧等［17］從甘蔗葉內(nèi)生真菌中利用化學(xué)顯色反應(yīng)、薄層層析法和紫外吸收光譜法篩選出3株鑒定為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）和黑曲霉（Aspergillus niger）的產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌。范瑛閣等［18］利用化學(xué)顯色法和薄層層析法從羅布麻葉中篩選出可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的鐮孢菌（Fusariumsp.）和嗜松青霉（Penicillin pinophilum）。張海龍等［19］利用黃酮類物質(zhì)顯色反應(yīng)、薄層層析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）從銀杏根部位篩選出卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）2株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

本研究選擇番木瓜為寄主植物作為試驗(yàn)材料，篩選獲得1株產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌并鑒定為橘青霉，與在其他寄主植物上已發(fā)現(xiàn)的具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的內(nèi)生真菌有所不同。其所產(chǎn)黃酮類物質(zhì)與番木瓜是否具有內(nèi)在聯(lián)系有待進(jìn)一步探究。本研究還發(fā)現(xiàn)了番木瓜其他內(nèi)生真菌對(duì)其中一種或數(shù)種顯色測(cè)試也有微弱的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，有可能是其內(nèi)生真菌菌株液體發(fā)酵后，得到的黃酮類物質(zhì)產(chǎn)量較低或次生代謝產(chǎn)物中成分復(fù)雜從而影響了顯色結(jié)果，這也會(huì)導(dǎo)致部分產(chǎn)黃酮菌株漏篩。因此下一步研究需要通過(guò)高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等更多檢測(cè)手段鑒別內(nèi)生真菌中次生代謝產(chǎn)物的成分［20］，并通過(guò)微生物誘變育種［21］、培養(yǎng)基配方改良、發(fā)酵條件優(yōu)化［22］等手段，提高內(nèi)生真菌在宿主植物體外培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的能力和穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究利用顯色反應(yīng)、TLC和UV法對(duì)番木瓜內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中是否含有黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了鑒別，篩選得到了1株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)成分的內(nèi)生真菌。并通過(guò)硝酸鋁顯色法測(cè)定了其菌絲體和發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中的總黃酮含量為0.187 8 mg/mL，表明其具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛在價(jià)值。同時(shí)提取了該內(nèi)生真菌總DNA，利用擴(kuò)增的ITS序列進(jìn)行菌株的分子鑒定，并結(jié)合PDA平板上的菌落形態(tài)特征和顯微鏡下產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，鑒定該內(nèi)生真菌菌株G41為橘青霉（P. citrinum）。本研究擴(kuò)展了篩選產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的寄主植物范圍，為利用番木瓜內(nèi)生真菌開發(fā)黃酮類活性成分提供了新的資源。