賀文俊 楊鐵釗 田培 段杜薇 李曉輝 何佳 周健飛

（河南農業(yè)大學，鄭州 450002）

烤煙上部葉約占整株煙葉葉數的33%，占煙葉總產量的40%左右，對烤煙總產質量有巨大貢獻［1］。優(yōu)質的上部煙葉具有高煙堿含量和香氣量，在現(xiàn)代低焦油烤煙型和混合型卷煙葉組配方中占重要地位，對卷煙的香氣和風格也有重要影響［2］。目前，我國上部煙葉葉片窄、組織結構致密、僵硬、填充性差，是導致上部葉質量較差、可用性偏低的重要因素［3-7］。因此，促進烤煙上部葉生長能有效提高煙葉的產量和品質。

溫度對烤煙上部葉生長發(fā)育、品質和產量產值等均具有一定影響。周越等［8］研究發(fā)現(xiàn)，夜溫升高能使烤煙上部葉葉長和葉寬顯著提高，產量產值顯著增加。王佩等［9］研究發(fā)現(xiàn)，成熟期增加地溫會使上部葉多酚和西柏類化合物含量降低，從而影響上部葉品質。聶榮邦等［10］研究發(fā)現(xiàn)，對煙株上部葉進行人工遮陰降溫處理有利于提高上部葉成熟度，提高上等煙比例。

目前，有關溫度對上部葉生長發(fā)育影響的機理研究尚少。本研究以云煙116為材料，研究增溫對上部葉胞壁羥脯氨酸含量、胞壁過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性和吲哚乙酸氧化酶（Indoleacetate oxidase，IAAO）活性的影響以及這些物質與葉片生長的關系。旨在為促進上部葉生長發(fā)育，提高煙葉產量產值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年在貴州省畢節(jié)市威寧縣黑石頭鎮(zhèn)煙草科技園試驗田中進行。試驗田海拔高度2 212 m，東經 104°01'06″，北緯 26°44'45″，屬亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，年均溫16℃，年降水量626 mm，無霜期191 d。試驗地土壤為黃棕壤，前茬作物菊花，土壤基礎肥力指標：全氮1.63 g/kg，堿解氮46.91 mg/kg，速效磷15.39 mg/kg，速效鉀82.00 mg/kg，有機質23.13 g/kg，土壤 pH 7.59。

供試烤煙品種為當地主栽品種云煙116。云煙116為8610-711與單育2號雜交育成的烤煙純系品種。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 設置2個處理：自然常溫對照（T1）和平頂后增溫處理（T2）。試驗采用小區(qū)對比設計，每處理重復3次，每處理100株烤煙，行距110 cm，株距60 cm。試驗小區(qū)設3壟保護行相隔，所有栽培措施與環(huán)境調控措施嚴格保持一致。

增溫處理各小區(qū)于7月10日搭設大棚，大棚面積約為63.3 m2，棚高約為2.2 m。大棚用不銹鋼管搭建固定，采用透光性極強的透明塑料專用膜覆蓋（青州市魯冠塑料廠生產），減少光質、光強等對試驗結果的干擾。為降低試驗過程中降雨對試驗的影響，對照也設置相應防雨棚（防雨棚材料與大棚相同）。為保證煙株生長用水，每隔5 d給煙株澆水。每個棚內放置一臺雙金屬自動記錄溫度儀進行溫度記錄。

1.2.2 測定項目及方法 于7月10日煙株平頂始取樣，并掛牌做標記定好葉位（自下向上數第17片葉），隨后每隔5 d取1次樣，共取5次，樣品液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

每次取樣時用卷尺測量已定位的第17片葉的葉長和葉寬，每次測量10株，用長寬法計算葉面積，葉面積=0.634 5×（葉長×葉寬）；利用液質聯(lián)用方法測定煙葉樣品中的羥脯氨酸（Hydroxyproline）含量 ；參照 Maehly和 Chance（1954）［11］的方法測定胞壁過氧化物酶活性；利用吲哚乙酸氧化酶試劑盒測定吲哚乙酸氧化酶活性；烘烤后煙葉按照國家烤煙分級標準GB2635-1992進行分級，按煙葉收購價格計算產值、均價與上等煙比例。

1.2.3 統(tǒng)計分析 試驗數據采用Excel 2003進行整理和制圖，采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果

2.1 不同處理下溫度變化分析

由圖1可看出，從7月10日至7月30日，平頂后大棚增溫處的棚內平均氣溫為25.1℃，而防雨棚內的平均氣溫僅為19.4℃。參照畢節(jié)市氣象臺發(fā)布的7月份溫度數據，發(fā)現(xiàn)7月10日至7月30日防雨棚內的日平均溫度與自然常溫幾乎相同，可以認為大棚內平均氣溫較自然常溫高5.7℃。說明搭建大棚可有效提升烤煙生長的環(huán)境溫度。

圖1 不同處理下日平均溫度變化示意圖

2.2 不同處理下烤煙上部葉的羥脯氨酸含量分析

由圖2可看出，2個處理上部葉的羥脯氨酸含量隨時間推移均呈降低趨勢，但較T1處理相比，T2處理的羥脯氨酸含量降低速率更快，從7月15日至7月30日，T2處理上部葉的羥脯氨酸含量顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當增溫可有效降低煙草上部葉葉片細胞壁的羥脯氨酸含量。

圖2 不同處理下上部葉的羥脯氨酸含量變化

2.3 不同處理下烤煙上部葉的POD活性分析

由圖3可看出，隨時間的推移，T1處理的上部葉POD活性呈先略升高后降低然后再升高的變化趨勢，而T2處理的上部葉POD活性則呈持續(xù)降低趨勢，從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉POD活性顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當增溫能夠降低上部葉葉片細胞壁的POD活性。

圖3 不同處理下上部葉的POD活性變化

2.4 不同處理下烤煙上部葉的IAAO活性分析

由圖4可看出，2個處理上部葉的IAAO活性隨時間推移均呈降低趨勢，但與T1處理相比，T2處理的上部葉的IAAO活性降低速率更快。從7月15日至7月30日，T2處理上部葉的IAAO活性顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當增溫能夠降低上部葉片的IAAO活性。

圖4 不同處理下上部葉葉片的IAAO活性變化

2.5 不同處理下烤煙上部葉生長發(fā)育情況的分析

由圖5可看出，2個處理的上部葉葉長均隨時間的推移而增長，且T2處理增加的速率大于T1處理。從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉葉長始終大于T1處理，且差異顯著（P＜0.05）。

圖5 不同處理下烤煙上部葉葉長變化

由圖6可看出，2個處理的上部葉葉寬也隨時間的推移而增寬，7月15日之前，T2處理的增長速率較快，7月15日之后，兩處理的增長速率相近。從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉葉寬始終大于T1處理，且差異顯著（P＜0.05）。7月30日時，T2處理的上部葉葉長、葉寬和葉面積分別較T1處理高8.6%、3.9%和12.9%。說明平頂后適當增溫能夠有效促進烤煙上部葉的生長發(fā)育。

2.6 不同處理下烤煙上部葉的經濟性狀差異分析

由表1可知，在平頂后增溫條件下，烤煙上部葉的經濟性狀指標均顯著提高。與T1處理相比，T2處理的產量、產值、均價和上等煙比例分別提高7.1%、13.8%、6.4%和4.9%。

圖6 不同處理下烤煙上部葉葉寬變化

表1 不同處理下烤煙上部葉經濟性狀比較

3 討論

本研究以烤煙品種云煙116為材料，測定平頂后不同溫度下上部葉胞壁羥脯氨酸含量、胞壁過氧化物酶活性和吲哚乙酸氧化酶活性。結果表明，在平頂后增溫條件下，胞壁過氧化物酶活性、吲哚乙酸氧化酶活性和胞壁羥脯氨酸含量均顯著降低，上部葉葉長、葉寬和葉面積均顯著提高。羥脯氨酸是伸展蛋白重要的組成物質，而伸展蛋白作為植物細胞壁結構蛋白，在初生壁中約占壁干質量的1%-15%，是影響細胞壁伸展性的重要因素之一［12］。而植物細胞伸長和擴大在很大程度上都取決于細胞壁的伸展性。因此，羥脯氨酸影響著植物細胞的生長。Cleland等［13］研究發(fā)現(xiàn)，豌豆上胚軸從伸長到停止這段時間內，細胞壁中的羥脯氨酸含量反而增加。Roberts等［14］研究發(fā)現(xiàn)，用多肽羥化酶阻遏物處理過的洋蔥根伸展蛋白水平降低，導致根細胞伸長。還有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)燕麥胚芽鞘的介質中加入脯氨酸，能抑制羥脯氨酸的形成，導致細胞伸展性增加［15］。這些研究表明伸展蛋白能夠抑制細胞的伸展，伸展蛋白的水平隨羥脯氨酸含量增加而提高。本研究發(fā)現(xiàn)經平頂后增溫處理后，細胞壁中的羥脯氨酸含量降低，而上部葉葉長、葉寬和葉面積顯著增加，有利于上部葉的生長，與前人研究結果相符。

伸展素（Expansin）是植物細胞生長期間釋放的一種能使細胞壁松弛的蛋白質。有研究表明，伸展素中大多羥脯氨酸（Hyp）殘基通過Hyp-O-Ara紐帶與壁多糖相聯(lián)，形成網絡，限制細胞生長（紐帶說）［16］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，伸展素多肽鏈間相鄰的異二酪氨酸（Idt）殘基通過二苯基醚鍵兩兩相連形成網絡，限制細胞生長（自身交聯(lián)說）［17］。而在這兩種途徑中，胞壁POD對Hyp和Idt的形成都起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，胞壁POD能夠催化伸展素中的脯氨酸（Pro）羥化，形成羥脯氨酸，使羥脯氨酸與脯氨酸之比增大，從而不利于細胞生長。POD也能使相鄰酪氨酸（Tyr）氧化形成Idt，限制細胞生長［18］。黃海等［19］研究了伸展蛋白與煙草葉細胞擴大生長的關系，結果表明，生長緩慢的圓片細胞壁強脯氨酸與脯氨酸的比值高于迅速生長的圓片。本研究發(fā)現(xiàn)，在增溫處理下，胞壁POD活性降低，羥脯氨酸含量減少，可能是因為POD活性降低，催化Pro羥基化能力變弱，羥脯氨酸與脯氨酸比值變小，導致葉片伸展。當然，也不排除自身交聯(lián)說。在增溫條件下，胞壁POD活性降低，可能使其氧化Tyr形成Idt的能力變弱，通過自身交聯(lián)形成的網絡就變少，從而促使細胞伸展。但也有研究表明，伸展素能參與植物細胞壁酸性擴張。Cosgrove實驗室分別從黃瓜下胚軸細胞壁和玉米花粉中分離出α-伸展素和β-伸展素，二者均能恢復細胞壁酸性擴張［20］，并據此推測伸展素在纖維素微纖絲表面擴散，以一種可逆的方式作用于與纖維素微纖絲表面緊密結合的基質聚合物，使多聚體網絡之間的氫鍵斷裂，膨壓驅使纖維素微纖絲與半纖維素相互之間滑動，從而引起細胞壁伸長［21］。本研究結果與其相反，可能是試驗材料和試驗環(huán)境不同導致的。由于本研究并未對Hyp、Tyr、Idt等物質進行測定，關于伸展素在POD的作用下抑制葉片生長的具體途徑還需進一步研究。

Lamport等［22］在研究POD的生理功能時發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶還能通過氧化生長素的方式影響細胞生長。IAA作為生長素中最重要的一種內源激素，與細胞分裂和擴大更是密切相關［23］。而IAAO和POD作為IAA分解過程中的關鍵酶，均能氧化分解IAA，調節(jié)植物生長［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，在平頂后增溫處理下，IAAO和POD活性降低，上部葉葉長、葉寬和葉面積增大。這是因為當IAAO和POD活性降低時，氧化分解IAA的能力變弱，因此，與對照相比，被分解的IAA較少，從而促進細胞生長，有利于上部葉開片。但關于IAA促進上部葉細胞生長的最適濃度還有待進一步研究。

4 結論

平頂后適當增溫能夠顯著降低烤煙上部葉葉片POD活性、IAAO活性和羥脯氨酸含量，顯著提高上部葉葉長、葉寬和葉面積，有效地促進烤煙上部葉的生長發(fā)育。經大棚增溫處理后，溫度提高了5.7℃，烤煙上部葉葉長、葉寬、葉面積、產量和產值顯著增加，較對照相比分別提高了8.6%、3.9%、12.9%、7.0%和13.8%。