張利君，申屠琰，鄭曉靜，劉哲宇，申屠基康，王志錚

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江余姚 315040；3.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315000)

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物經(jīng)常面臨的環(huán)境脅迫因子。據(jù)報(bào)道，氨氮脅迫會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物體內(nèi)生成自由基[1]，水環(huán)境中任何可測的氨氮質(zhì)量濃度對水生動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生有害影響[2]，水生動(dòng)物為應(yīng)對氨毒侵害，往往會(huì)采取降低自身產(chǎn)氨量，以保持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的耐氨策略[3-4]，當(dāng)氨氮脅迫強(qiáng)度持續(xù)超過水生動(dòng)物機(jī)體調(diào)節(jié)閾值時(shí)，會(huì)造成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的破壞，和部分抗氧化物質(zhì)含量及酶活性的降低，導(dǎo)致機(jī)體清除自由基能力的顯著下降[5]。因此，研究氨氮急性攻毒及去毒恢復(fù)后目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物抗氧化酶活力的變化特征，進(jìn)而探究目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的抗氧化保護(hù)對策與機(jī)制，無疑對指導(dǎo)目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的安全養(yǎng)殖具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

棘胸蛙Paa spinosa隸屬于兩棲綱、無尾目、蛙科、棘蛙屬，系我國南方丘陵地區(qū)生長的一種特有大型食用蛙，素有“百蛙之王”之美譽(yù)，現(xiàn)已成為我國南方部分山區(qū)的重要特種養(yǎng)殖對象。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫因子(如水體pH、溫度、鹽度、氨氮等)變化誘導(dǎo)的生理效應(yīng)可能經(jīng)由氧化還原途徑實(shí)現(xiàn)[6-7]，棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚和肝臟作為氨氮攻毒的主要靶器官[8]，兩者抗氧化酶和尾部皮膚ATP酶是應(yīng)答水溫耐受與響應(yīng)的重要生理靶標(biāo)[9]?；诖?，筆者以棘胸蛙蝌蚪為研究對象，開展了氨氮急性攻毒及去毒恢復(fù)期間肝臟SOD、CAT、GSH及尾部皮膚SOD、CAT、ATP酶活力的變化特征研究，試圖從抗氧化酶學(xué)角度進(jìn)一步探究蝌蚪的氨毒耐受與響應(yīng)機(jī)制，以期為該蛙蝌蚪的集約化安全養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

本研究在浙江海洋大學(xué)安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。所用供試蝌蚪、實(shí)驗(yàn)水源及實(shí)驗(yàn)用水配置與日換水方法完全同牛春格等[8]。根據(jù)氨氮對棘胸蛙蝌蚪急性攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，設(shè)置 0 mg·L-1(對照組)、2.45 mg·L-1、4.90 mg·L-1、7.35 mg·L-1、9.80 mg·L-1、12.25 mg·L-1、14.70 mg·L-1、17.15 mg·L-1、19.60 mg·L-1等 9 個(gè)氨氮質(zhì)量濃度梯度，以內(nèi)徑32 cm的白色平底塑料園盆為實(shí)驗(yàn)容器單元(實(shí)驗(yàn)實(shí)際容積為5 L)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器單元內(nèi)各放供試蝌蚪12 ind，采用靜水停飼實(shí)驗(yàn)法，以96 h為氨氮脅迫時(shí)長，12 d為去毒恢復(fù)(實(shí)驗(yàn)用水氮質(zhì)量濃度為 0 mg·L-1)時(shí)長，以 24 h、48 h、72 h、96 h和去毒后 6 d、12 d為測定時(shí)點(diǎn)，開展氨氮對棘胸蛙蝌蚪尾部ATP、SOD、CAT和肝臟SOD、CAT、GSH酶活力的影響實(shí)驗(yàn)。每一測定時(shí)點(diǎn)從各實(shí)驗(yàn)梯度中任取實(shí)驗(yàn)蝌蚪3 ind，于冰盤上解剖取尾部皮膚組織和肝臟后，逐一編號并保存于-80℃超低溫冰箱備測。本研究所用酶活力測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，以島津UV-1240型紫外可見分光光度計(jì)為檢測儀，測定步驟及計(jì)算方法按所附說明書。采集實(shí)驗(yàn)所測數(shù)據(jù)，借助SPSS 17.0軟件，采用LSD多重比較法檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)梯度組間的差異顯著性(P＜0.05為顯著水平)。

2 結(jié)果

2.1 尾部皮膚ATP酶活力

由圖1可見，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪尾部皮膚ATP酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：(1)急性攻毒階段，各測定時(shí)點(diǎn)酶活力均有隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加而呈顯著下降的趨勢(P<0.05)；(2)去毒恢復(fù)階段，隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加，各測定時(shí)點(diǎn)酶活力大體上均呈先升后降的趨勢，峰值均出現(xiàn)于氨氮質(zhì)量濃度17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，且其它實(shí)驗(yàn)組酶活力則均顯著大于對照組(P<0.05)。由此可知，蝌蚪尾部皮膚ATP酶對氨氮極為敏感，原氨氮質(zhì)量濃度17.15 mg·L-1為去毒后蝌蚪尾部皮膚ATP酶活力獲得補(bǔ)償性提高的高限。

圖1 氨氮急性攻毒及去毒后棘胸蛙蝌蚪尾部ATP酶活力的變化特征Fig.1 Characteristics of ATPase activity in the tail of P.spinosa tadpoleafter acute challenge with ammonia and detoxification

2.2 肝臟和尾部皮膚SOD酶活力

由圖2可見，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪肝臟和尾部皮膚SOD酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：(1)急性攻毒階段，隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加，肝臟和尾部皮膚各測定時(shí)點(diǎn)酶活力大體上均呈先升后降的趨勢，峰值均出現(xiàn)于氨氮質(zhì)量濃度2.45 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組 (P<0.05)，且其它實(shí)驗(yàn)組酶活力則均顯著低于對照組P<0.05)；(2)去毒恢復(fù)階段，對照組肝臟和尾部皮膚酶活力均顯著低于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加，肝臟各測定時(shí)點(diǎn)酶活力大體上均呈先升后降的趨勢，峰值均出現(xiàn)于17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，尾部皮膚去毒6d時(shí)酶活力大體上呈先升后平趨勢，并于17.15 mg·L-1和 19.6 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組到達(dá)峰值(P<0.05)，去毒12 d時(shí)酶活力大體上均呈先升后降的趨勢，于17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組到達(dá)峰值 (P<0.05)。由此可知，肝臟和尾部皮膚SOD酶對氨氮攻毒表露毒性興奮效應(yīng)的終點(diǎn)質(zhì)量濃度均為2.45 mg·L-1，且兩者去毒后SOD酶活力獲得補(bǔ)償性提高的原氨氮質(zhì)量濃度高限均為17.15 mg·L-1，去毒階段肝臟在SOD酶活力的生理補(bǔ)償上較尾部皮膚具更強(qiáng)的敏感性。

圖2 氨氮急性攻毒及去毒后棘胸蛙蝌蚪肝臟和尾部SOD酶活力的變化Fig.2 Changes of SOD activity in the liver and tail of P.spinosa tadpoleafter acute challenge with ammonia nitrogen and detoxification

2.3 肝臟和尾部皮膚CAT酶

由圖3可見，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪肝臟和尾部皮膚CAT酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：(1)急性攻毒階段，肝臟和尾部皮膚各測定時(shí)點(diǎn)酶活力隨氨氮攻毒濃度增加均呈先升后降趨勢(P<0.05)，峰值均出現(xiàn)于氨氮質(zhì)量濃度 14.70 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)，且17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組和 19.60 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的酶活力均顯著低于對照組(P＜0.05)；(2)去毒恢復(fù)階段，肝臟和尾部皮膚酶活力隨氨氮質(zhì)量濃度的升高亦呈先升后降趨勢，峰值均出現(xiàn)于17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組。由此可知，肝臟和尾部皮膚CAT酶對氨氮攻毒表露毒性興奮效應(yīng)的終點(diǎn)質(zhì)量濃度均為14.70 mg·L-1，且兩者去毒后 CAT 酶活力獲得補(bǔ)償性提高的原氨氮質(zhì)量濃度高限均為 17.15 mg·L-1。

圖3 氨氮急性攻毒及去毒后棘胸蛙蝌蚪肝臟和尾部皮膚CAT酶活力的變化Fig.3 Changes of CAT enzyme activity in the liver and tail skin of P.spinosa tadpoleafter acute challenge with ammonia nitrogen and detoxification

2.4 肝臟GSH酶活力

由圖4可見，實(shí)驗(yàn)期間蝌蚪肝臟GSH酶活力的變化特征主要表現(xiàn)為：(1)急性攻毒階段，各測定時(shí)點(diǎn)酶活力隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度的增加呈先升后降趨勢(P＜0.05)，峰值均出現(xiàn)于氨氮質(zhì)量濃度14.70 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組，且其它實(shí)驗(yàn)組酶活力均顯著大于對照組(P＜0.05)；(2)去毒恢復(fù)階段，酶活力亦隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度的增加呈先升后降趨勢，且峰值均出現(xiàn)于17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。由此可知，肝臟 GSH 酶對氨氮攻毒表露毒性興奮效應(yīng)的終點(diǎn)質(zhì)量濃度為14.70 mg·L-1，氨氮質(zhì)量濃度 17.15 mg·L-1為去毒后蝌蚪肝臟GSH酶活力獲得補(bǔ)償性提高的高限。

圖4 氨氮急性攻毒及去毒后棘胸蛙蝌蚪肝臟GSH酶活力的變化Fig.4 Changes ofGSH enzyme activity in the liver of P.spinosa tadpole after acute challenge with ammonia nitrogen and detoxification

3 討論

3.1 關(guān)于氨氮急性攻毒下棘胸蛙蝌蚪的抗氧化保護(hù)對策

棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚ATP酶活力隨氨氮急性攻毒質(zhì)量濃度增加持續(xù)下降 (P＜0.05)(圖 1)，與晝均、夜均和日均排氨率均隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加持續(xù)受抑的結(jié)果[8]，客觀反映了氨氮脅迫下棘胸蛙蝌蚪尾部運(yùn)動(dòng)與機(jī)體排氨速率間的協(xié)同關(guān)系?？寡趸赶到y(tǒng)作為生物抗氧化應(yīng)激的第一道防線，在正常生理狀況下，可有效清除因污染脅迫產(chǎn)生的自由基，起到保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的作用[8，10]。其中，SOD 作為最能代表機(jī)體抗氧化防御變化特征的指標(biāo)酶[11]，可催化超氧陰離子基團(tuán)生成H2O2和O2；CAT可還原H2O2以維持細(xì)胞和機(jī)體的正常生理活動(dòng)[12]，故常作為生物標(biāo)志物，用以預(yù)測和評價(jià)水體污染及水生生物中毒程度[13-14]；GSH可間接還原過氧化物或直接消除羥自由基，以降低細(xì)胞氧化受損水平，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[15-17]。無疑，本研究所涉棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚和肝臟抗氧化酶類酶活力隨氨氮急性攻毒質(zhì)量濃度增加均呈先升后降的變動(dòng)特征，以及兩者間同種抗氧化酶走勢均基本一致的情形(圖2，圖3，圖4)，與晝均、夜均和日均耗氧率隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加均表露出低毒興奮效應(yīng)的結(jié)果[8]，充分反映了受氨氮脅迫下棘胸蛙蝌蚪尾部皮膚與肝臟在抗氧化酶活力變動(dòng)上的協(xié)同關(guān)系，以及機(jī)體抗氧化能力與耗氧率間的內(nèi)在聯(lián)系。綜上，本研究所涉酶活力隨氨氮攻毒質(zhì)量濃度增加引起的變動(dòng)特征，無疑揭示了氨氮急性攻毒下棘胸蛙蝌蚪以表露低毒興奮效應(yīng)為特征，采取通過顯著降低機(jī)體運(yùn)動(dòng)與排泄能耗，以顯著增強(qiáng)抗氧化能力的避毒生存策略，從而進(jìn)一步佐證了氨毒作用下棘胸蛙蝌蚪的呼吸與排泄代謝特征。

3.2 關(guān)于氨氮急性攻毒及去毒后棘胸蛙蝌蚪抗氧化酶系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)制的探討

棘胸蛙蝌蚪皮膚密布毛細(xì)血管，系機(jī)體與外界進(jìn)行氣體交換的主要場所。據(jù)報(bào)道，蝌蚪約60%的氧依靠皮膚吸收[18]。急性攻毒階段，蝌蚪尾部皮膚和肝臟SOD酶表露氨毒興奮效應(yīng)峰值的氨氮質(zhì)量濃度為2.45 mg·L-1，而兩者 CAT 酶和肝臟 GSH 酶則均為 14.70 mg·L-1的結(jié)果(圖 2，圖 3，圖 4)，表明 SOD 酶對氨氮急性攻毒較CAT和GSH酶更具敏感性。與此相對性，牛春格等[8]研究發(fā)現(xiàn)，受氨氮脅迫下，棘胸蛙蝌蚪夜均、晝均、日均及時(shí)段排氨率與對照組均無顯著差異的僅為2.45 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P＞0.05)，夜均、晝均和日均耗氧率對照組均無顯著差異的僅為14.70 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P＞0.05)。由此可推定，SOD酶為清除體內(nèi)氨毒自由基的誘導(dǎo)酶，CAT和GSH酶為清除體內(nèi)氨毒自由基的主導(dǎo)酶，SOD酶所表露的低毒興奮效應(yīng)對維系棘胸蛙蝌蚪正常排泄能耗具重要支持作用，CAT和GSH酶活力取得峰值的氨氮質(zhì)量濃度為棘胸蛙蝌蚪皮膚供氧能力明顯受抑(P＜0.05)的分水嶺。無疑，受氨氮急性攻毒下棘胸蛙蝌蚪CAT和GSH酶活力與耗氧率間的相關(guān)性，進(jìn)一步印證了牛春格等[8]所述14.70 mg·L-1為棘胸蛙蝌蚪耐受氨氮急性脅迫的安全質(zhì)量濃度上限的可靠性。與此同時(shí)，去毒恢復(fù)階段，本研究所涉酶類酶活力隨原氨氮急性攻毒質(zhì)量濃度增加均呈先升后降的變動(dòng)特征，峰值均出現(xiàn)于原氨氮質(zhì)量濃度17.15 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，且均以對照組為最低(P＜0.05)的結(jié)果(圖 1，圖 2，圖 3，圖 4)，指示 17.15 mg·L-1為棘胸蛙蝌蚪耐受氨氮急性脅迫下生理機(jī)能尚可恢復(fù)的臨界。因此，在棘胸蛙蝌蚪培育過程中應(yīng)加強(qiáng)對養(yǎng)殖水體氨氮質(zhì)量濃度的監(jiān)測力度，并通過及時(shí)換水以確保棘胸蛙蝌蚪正常生長和變態(tài)。