崔 偉，高 鋒，朱 鳳，徐晶萍，鮑靜姣，郭遠明

(1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

隨著人們生活水平的不斷提高，人們對魚、蝦等海產(chǎn)品的需求量與日俱增，從而使國內(nèi)外海水養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展。但是，海水養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展也帶來了一些問題，特別是海水養(yǎng)殖廢水的處理問題[1-5]。從海水養(yǎng)殖場排放出來的廢水，通常以含氮、磷的營養(yǎng)鹽為主，主要來自水產(chǎn)品的排泄物和飼料殘渣[6-7]。目前，國內(nèi)外學者已經(jīng)對海水養(yǎng)殖廢水的處理方法進行了很多研究，如采用生物硝化/反硝化過程來去除其中的氮[8-9]，采用化學沉淀方法來除磷等[10]。這些方法雖然能有效的去除廢水中一定量的氮磷營養(yǎng)鹽，但也存在處理過程能耗較高、脫氮除磷不徹底、副產(chǎn)的剩余污泥需要進一步無害化處理等問題。

光自養(yǎng)微藻通過光合作用能有效的將無機營養(yǎng)鹽、CO2、H2O等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等有機物質(zhì)。一些研究表明，微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中生長是可行的[11-15]。利用海水養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)微藻，在去除營養(yǎng)物質(zhì)的同時，能獲得有價值的微藻產(chǎn)品，如水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料和生物燃料原料等[16-19]。此外，微藻在生長過程中還能固定空氣中CO2為減輕溫室效應做出貢獻，其光合作用產(chǎn)生的氧氣還能提高受納水體中溶解氧的含量。

但是到目前為止，微藻培養(yǎng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水營養(yǎng)鹽去除方面的競爭力還不夠強，尚難以成為經(jīng)濟高效的廢水處理工藝。主要問題在于由于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中營養(yǎng)鹽濃度的限制，微藻在其中的生長較為緩慢，所以吸收廢水中的營養(yǎng)成分需要較長的水力停留時間(hydraulic retention time，HRT)。之前的一些研究表明，采用批次培養(yǎng)方式在海水養(yǎng)殖廢水中進行微藻培養(yǎng)，廢水中的大部分營養(yǎng)鹽可以通過微藻細胞的吸收作用去除[13，20]，但是也應該指出，這些研究中批次培養(yǎng)需要的時間相當長(約10 d)。因此，在實際工程中就需要體積較大的反應器才能完成廢水處理過程。

通常在光生物反應器(photobioreactor，PBR)中，微藻生物的高速生產(chǎn)需要通過反應器內(nèi)較高的營養(yǎng)鹽負荷和較高的微藻濃度來實現(xiàn)。由于海水養(yǎng)殖廢水中的氮磷的濃度遠低于BG11等傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)基，因此要提高培養(yǎng)系統(tǒng)的營養(yǎng)負荷就需要提高海水養(yǎng)殖廢水的供應流量。但是這在HRT和生物質(zhì)停留時間(biomass retention time，BRT)不是獨立控制的傳統(tǒng)光生物反應器中將導致微藻細胞的大量流失，而難以實現(xiàn)高濃度培養(yǎng)。

近年來，包括本課題組在內(nèi)的一些研究人員對一種新型的配備有浸沒式膜組件的光生物反應器進行了初步的研究[21-23]，浸沒式膜組件作為水和微藻的分離單元，促使膜-光生物反應器(membrane photobioreactor，MPBR)實現(xiàn)了HRT和BRT的獨立控制。在較高的水力負荷條件下，仍能使反應器中微藻的停留時間延長，微藻濃度可不受其生長速率及水力負荷的影響。這不僅有利于微藻細胞的收獲，而且極大地提高了微藻光生物反應器在污水氮磷深度去除領域的競爭力。

在本研究中，首先通過傳統(tǒng)的錐形瓶分批培養(yǎng)方式研究了小球藻和衣藻兩種微藻在海水養(yǎng)殖廢水中的生長情況，以評估微藻在海水養(yǎng)殖廢水中的生長速率和生物量生產(chǎn)能力。在此基礎上在MPBR反應器中利用海水養(yǎng)殖廢水對2種微藻進行連續(xù)進出水培養(yǎng)，以研究MPBR中微藻連續(xù)進出水培養(yǎng)對海水養(yǎng)殖廢水中氮磷營養(yǎng)鹽的去除效果及微藻生長特性。

1 材料與方法

1.1 藻種和廢水

實驗所用藻種為小球藻Chlorella vulgaris和衣藻Chlamydomonas reinhartii，均購自中國科學院水生生物研究所，逐級在5.0、10.0、20.0鹽度下馴化后應用于本實驗。本研究中使用的海水養(yǎng)殖廢水取自浙江省舟山市某海水養(yǎng)殖場對蝦養(yǎng)殖池出水，放置一夜，然后收集澄清的上清液并用于實驗。實驗用水水質(zhì)如表1 所示，鹽度為 20.7。

表1 實驗中所用海水養(yǎng)殖廢水水質(zhì)Tab.1 Characteristics of the saline aquaculture wastewater

由表1中數(shù)據(jù)可知，廢水中溶解性無機氮(DIN)與總氮(TN)的比值為0.91：1，溶解性無機磷(DIP)與總磷(TP)的比值為0.93：1，由此可見無機營養(yǎng)鹽是該廢水中主要的營養(yǎng)鹽形式。因此，在后續(xù)的研究中，采用DIN和DIP作為廢水的營養(yǎng)鹽指標。

1.2 批次培養(yǎng)實驗

通過離心(6 000 r·min-1，15 min)收集對數(shù)生長期的微藻細胞，然后接種到含有250 mL海水養(yǎng)殖廢水的1 L錐形瓶中。對于每個藻種，使用3個重復錐形瓶，平均生物量濃度約為0.014 g·L-1。將所有錐形瓶放置在光照恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與1.1部分相同。

1.3 MPBR 反應器

實驗中使用的MPBR反應器為圓柱形有機玻璃容器，內(nèi)徑8.0 cm(圖 1)。反應器的總體積和工作體積分別為 1.5 L 和 1.0 L。反應器中間放置一固液分離用的中空纖維超濾膜組件，材質(zhì)為聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)，膜孔徑為 0.01 μm，膜組件中膜表面的有效面積為0.02 m2。反應器的光照由2個紅/藍光比為4：1、功率為9 W的LED燈提供，并放置在離反應器表面2 cm的距離處。在反應器的底部，安裝了兩個氣體分配器。其中一個氣體分配器連接空壓機進行曝氣，在反應器中起到攪拌的作用。通過另一個氣體分配器向反應器注入純二氧化碳(99.9%)，以調(diào)節(jié)反應器中的pH。

圖1 MPBR實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the MPBR

1.4 微藻在MPBR反應器中的連續(xù)進出水培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的小球藻和衣藻細胞經(jīng)離心收集(6 000 r·min-1，15 min)后分別接種至MPBR反應器中，接種濃度均約為0.23 g·L-1。接種完成后連續(xù)向反應器內(nèi)供應海水養(yǎng)殖廢水，出水通過超濾膜組件和抽濾泵排出反應器，進水流量和出水流量相等，反應器內(nèi)的HRT控制為1.0 d。在整個實驗階段，反應器表面的最大光強度約為180 μmol·m-2·s-1，空氣流量控制在0.5 L·min-1。所有反應器放置在溫度保持在25±2℃的室內(nèi)，培養(yǎng)液pH值在6.8～7.2。實驗過程中每日對反應器內(nèi)的微藻濃度及進出水水質(zhì)進行分析測定。

1.5 分析測試方法

實驗過程中微藻濃度的測定采用重量法。離心收集微藻細胞(7 000 g，10 min，4℃)，然后冷凍干燥并稱重[24]。

對于廢水水質(zhì)分析，反應器進水水樣在測試分析前用0.45 μm孔徑濾膜過濾處理。實驗中廢水水質(zhì)的測定依據(jù)《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.4-2007)進行，另外pH測定采用一pH計(PHB4，REX)，水樣中的鹽度采用鹽度計(US61M/YSI-30)直接測定。

1.6 計算

實驗過程中微藻比生長速率(specific growth rate，SGR)的計算如公式(1)所示[23]。

其中W1和W2分別為培養(yǎng)開始時(t1)和t2時的微藻生物量。

微藻倍增時間(Td)的計算如公式(2)所示[23]。

MPBR反應器中微藻生產(chǎn)速率的計算如公式(3)所示。

其中X1為培養(yǎng)開始時的微藻濃度，Xmax為培養(yǎng)過程中微藻濃度達到的最大值，△t為從實驗開始至微藻濃度達到最大值所經(jīng)歷的時間間隔。

MPBR反應器獲得的營養(yǎng)鹽去除速率的計算如公式(4)所示。

其中Cinf和Ceff分別為反應器進出水的營養(yǎng)鹽濃度(DIN或DIP)，Q為反應器的進水流量(4.0 L·d-1)，V為反應器的有效容積(4.0 L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻在海水養(yǎng)殖廢水中的批次培養(yǎng)

圖2為用海水養(yǎng)殖廢水分批培養(yǎng)小球藻和衣藻的微藻生長曲線。從圖2可以看出，接種完成后小球藻和微藻均實現(xiàn)了快速生長，從2個藻種的生長曲線中均沒有觀察到停滯期，這表明這2種淡水微藻對于所使用的海水養(yǎng)殖廢水具有良好的適應性。從2種微藻的生長曲線可知，對于小球藻和衣藻，前期為指數(shù)生長階段，在第7天小球藻和衣藻濃度均達到最高值，之后進入穩(wěn)定生長期和衰亡期?？梢杂嬎愠鲂∏蛟搴鸵略逶谥笖?shù)生長階段的生物量生產(chǎn)速率分別為11.0和8.9 mg·L-1·d-1(表 2)。由表 2 中的數(shù)據(jù)可知，本次實驗微藻在海水養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)獲得的生物量生產(chǎn)速率遠遠低于文獻中微藻在其他營養(yǎng)鹽含量較高廢水中培養(yǎng)所獲得的微藻生產(chǎn)速率。表明利用批次培養(yǎng)的方法，以低營養(yǎng)鹽含量的海水養(yǎng)殖廢水為培養(yǎng)基，無法獲得較高的微藻生物量生產(chǎn)速率。

圖2 小球藻和衣藻在海水養(yǎng)殖廢水中批次培養(yǎng)的生長曲線Fig.2 Growth curves of Chlorella vulgaris and Chlamydomonas reinhartii batch cultured in saline aquaculture wastewater

表2 本實驗所得結(jié)果與一些文獻中研究結(jié)果的比較Tab.2 Comparison of the experimental results with the previous studies

如果采用持續(xù)供應海水養(yǎng)殖廢水的方式進行微藻培養(yǎng)，則可以為微藻培養(yǎng)系統(tǒng)維持較高的營養(yǎng)鹽供應負荷，但同時懸浮培養(yǎng)的微藻將從培養(yǎng)系統(tǒng)中大量流失，從而難以將系統(tǒng)中的微藻濃度維持在理想的水平。TANG Haiying，et al[25]對連續(xù)進出水的微藻培養(yǎng)光生物反應器進行了研究，結(jié)果表明，稀釋率(進水流量與反應器中液體體積的比值)的變化對光生物反應器中的微藻濃度和生物量生產(chǎn)均具有重要的影響，隨著稀釋率的逐漸增大，反應器內(nèi)的微藻濃度呈逐漸降低的趨勢。在本研究中，前6天的小球藻和衣藻平均比生長速率(SGR)分別為0.29 d-1、0.26 d-1(從圖2的數(shù)據(jù)計算得出)?？梢杂嬎愠霰狙芯恐蟹峙囵B(yǎng)小球藻和衣藻的倍增時間分別為2.39和2.67 d。因此，假設連續(xù)培養(yǎng)中微藻的生長速度與批次培養(yǎng)相似，要保持培養(yǎng)

系統(tǒng)中微藻濃度的大體穩(wěn)定，培養(yǎng)系統(tǒng)的HRT將不得低于微藻的倍增時間，也就是需要保持在3 d以上，此時光生物反應器將需要比較大的體積。此外，從圖2可以看出，通過批次培養(yǎng)微藻的生物量濃度增加量非常低。小球藻和衣藻指數(shù)生長期的生物量增長量分別為0.066和0.053 g·L-1，這將導致培養(yǎng)后微藻細胞的收獲成本非常高。因此，可以得出結(jié)論，如果沒有培養(yǎng)過程中HRT和BRT的獨立控制，低營養(yǎng)鹽含量的海水養(yǎng)殖廢水難以作為微藻培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.2 微藻在MPBR中的連續(xù)進出水培養(yǎng)

圖3 小球藻和衣藻在MPBR中連續(xù)進出水培養(yǎng)的生長曲線Fig.3 Growth curves of C.vulgaris and C.reinhartii continuously cultured in MPBR

小球藻和衣藻在MPBR連續(xù)進出水運行過程中的生長情況如圖3所示。MPBR反應器中的超濾膜組件能實現(xiàn)對反應器內(nèi)微藻細胞的完全截留，因而促使反應器能以連續(xù)進出水方式進行微藻的連續(xù)培養(yǎng)。在本實驗中MPBR反應器的HRT控制為1.0 d，連續(xù)進水的低氮磷含量水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水為反應器內(nèi)微藻的生長提供了充足的生長所需的營養(yǎng)鹽。在32 d的培養(yǎng)過程中，小球藻和衣藻在MPBR反應器內(nèi)均實現(xiàn)了長期的連續(xù)生長，最高生物量濃度分別達到1.44和1.28 g·L-1(圖3)，經(jīng)過計算可知在MPBR的連續(xù)培養(yǎng)過程中，小球藻和衣藻的生物量生產(chǎn)速率分別為37.9和32.4 mg·L-1·d-1，是采用同樣的藻種和廢水在批次培養(yǎng)中指數(shù)生長階段微藻生物量生產(chǎn)速率的3.4倍和3.6倍(表2)，表明這2種微藻在MPBR反應器連續(xù)進出水的培養(yǎng)過程中對海水養(yǎng)殖廢水都變現(xiàn)出較好的適應性，不存在明顯的差異。另外，值得注意的是實驗所獲得的這一微藻生物量生產(chǎn)速率也高于或接近于以往研究中使用市政，工業(yè)或家禽養(yǎng)殖廢水批次培養(yǎng)微藻所獲得的微藻生物量生產(chǎn)速率，盡管這些廢水中的氮磷濃度遠高于本研究中使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水(表2)。因此，可以認為MPBR利用低氮磷含量的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水實現(xiàn)了微藻的濃縮培養(yǎng)同時也取得了較高的微藻生物量生產(chǎn)速率?？梢姡捎肕PBR反應器能較好的解決海水養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)微藻過程中存在的氮磷濃度低導致微藻生產(chǎn)受限的問題，使低氮磷含量的海水養(yǎng)殖廢水成為了潛在的微藻培養(yǎng)液，這對于海水養(yǎng)殖行業(yè)和微藻培養(yǎng)行業(yè)都具有一定的價值。

2.3 MPBR對廢水中營養(yǎng)鹽的去除效果

實驗過程中對小球藻MPBR反應器和衣藻MPBR反應器每日進出水的氮、磷濃度進行了監(jiān)測。對于實驗所用的養(yǎng)殖廢水，由表1中的數(shù)據(jù)可知，廢水中氮的主要形式為NH4+-N。對于廢水中NH4+-N的去除，如圖4和圖5所示，兩反應器在最初的5 d運行過程中，出水NH4+-N濃度呈逐漸下降的趨勢，在之后的運行過程中，兩反應器出水NH4+-N濃度穩(wěn)定在較低的水平。在穩(wěn)定運行階段，實驗過程中兩反應器出水的平均NH4+-N濃度分別為0.29和0.31 mg·L-1。實驗所用養(yǎng)殖廢水中NO2--N和NO3--N的濃度均較低 (表1)，經(jīng)MPBR反應器中微藻培養(yǎng)處理后，出水NO2--N和NO3--N濃度均仍然保持在較低的水平(圖4，圖5)，表明在MPBR反應器處理廢水的過程中，并沒有發(fā)生明顯的微生物的硝化反應，廢水中的NH4+并未被氧化為NO2--N和NO3--N。

圖4 小球藻MPBR運行過程中出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N濃度的變化Fig.4 Effluent concentrations of NH4+-N、NO2--N、NO3--N of the C.vulgaris MPBR throughout the continuous cultivation period

圖5 衣藻MPBR運行過程中出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N濃度的變化Fig.5 Effluent concentrations of NH4+-N、NO2--N、NO3--N of the C.reinhartii MPBR throughout the continuous cultivation period

實驗過程中兩反應器對廢水中DIP的去除效果如圖6所示。從圖6可以看出，出水中DIP的變化情況與NH4+-N的變化情況較為類似。在最初的3 d運行過程中，出水DIP濃度呈逐漸下降的趨勢，在之后的運行過程中，兩反應器出水DIP濃度穩(wěn)定維持在較低的水平。

圖6 小球藻和衣藻MPBR運行過程中出水DIP濃度的變化Fig.6 Effluent DIP concentrations of the C.vulgaris MPBR and C.reinhartii MPBR throughout the continuous cultivation period

對于兩反應器所取得的脫氮除磷效果，本研究計算了穩(wěn)定運行階段MPBR反應器對廢水中DIN和DIP的去除率和去除速率，結(jié)果如表3所示。兩反應器對廢水中DIN的去除率分別達了93.9%和93.6%，對DIP的去除率分別達到98.8%和99.0%，可見在MPBR反應器中進行微藻的連續(xù)進出水培養(yǎng)實現(xiàn)了對養(yǎng)殖廢水中氮磷的高效去除，并且2種微藻對廢水中氮、磷的去除能力非常接近，說明，兩者在海水養(yǎng)殖廢水中營養(yǎng)鹽的去除能力上并不存在明顯的差異。另外，值得注意的是本實驗所取得的對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氮磷的去除效果類似或優(yōu)于文獻報道中采用傳統(tǒng)批式微藻培養(yǎng)方法所取得的對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氮磷的去除效果[20-21]，而在這些批次培養(yǎng)的微藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水實驗中，廢水的停留時間(HRT)通常在10 d以上，遠高于本實驗中所采用的MPBR反應器1.0 d的HRT。MPBR反應器較短的HRT也促使本實驗獲得了較高的對廢水中營養(yǎng)鹽的去除速率，兩反應器對DIN的去除速率分別達到5.28和5.26 mg·L-1·d-1，對 DIP 的去除速率分別達到 0.395 和 0.396 mg·L-1·d-1(表 3)。由此可見，采用膜法微藻濃縮培養(yǎng)方法既實現(xiàn)了反應器內(nèi)微藻的高效生產(chǎn)，同時也實現(xiàn)了對進水中氮磷等營養(yǎng)鹽的高效去除，有利于促進微藻培養(yǎng)方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理工程中發(fā)揮更大的作用，同時也為循環(huán)海水養(yǎng)殖行業(yè)提供了一種新的水處理方法。

表3 穩(wěn)定運行階段MPBR對廢水中營養(yǎng)鹽的去除效果Tab.3 Nutrient removal performance of MPBR after stabilization

3 結(jié)論

(1)MPBR反應器中的超濾膜組件能實現(xiàn)對反應器中微藻細胞的完全截留，從而實現(xiàn)了采用低氮磷含量的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水進行微藻的連續(xù)進出水培養(yǎng)。

(2)相比于傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)方式，MPBR反應器連續(xù)進出水的培養(yǎng)方式取得了更高的微藻生物量生產(chǎn)速率。反應器水力停留時間控制為1.0 d，小球藻和衣藻的生物量生產(chǎn)速率分別達到批次培養(yǎng)時的3.4和3.6 倍。

(3)通過在MPBR反應器中進行微藻的連續(xù)進出水培養(yǎng)實現(xiàn)了對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的深度脫氮除磷操作，為循環(huán)海水養(yǎng)殖行業(yè)提供了一種新的水處理方法。