婁宇棟，馮 建 ，何嬌嬌，晁 帥 ，王 萍 ，2

(1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江省海洋養(yǎng)殖裝備與工程技術重點實驗室，浙江舟山 316022；2.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211)

水流是魚類生長發(fā)育的基礎環(huán)境，魚類的生長、繁殖、遷徙和種群分布都受到水流的影響[1-3]。現(xiàn)階段有關水流對魚類的影響主要集中在游泳機制和游泳速率等方面[4]。隨著研究技術和方法的深入，許多學者開始從分子水平研究流速對魚類的生理影響。MAGNONI，et al[5]在研究虹鱒魚Oncorhynchus mykiss的肌肉轉(zhuǎn)錄組時發(fā)現(xiàn)，虹鱒魚在最大續(xù)航游泳速度下游泳時能量和物質(zhì)表達的相關基因大量參與表達。PALSTRA，et al[6]研究發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)的游泳刺激下，虹鱒幼魚骨骼肌中白肌肉生長發(fā)育的基因出現(xiàn)明顯上調(diào)。同時PALSTRA，et al[7]還發(fā)現(xiàn)，在流速影響下，斑馬魚Danio rerio的胰島素樣生長因子受體、生長激素受體等出現(xiàn)明顯差異表達。在其它的魚類研究中，免疫[8]、低溫脅迫[9]、營養(yǎng)代謝機制[10]等大量相關基因被發(fā)現(xiàn)并得到證實。這些研究使人們從分子水平上對魚類的行為機制有了新的認識，同時給魚類的網(wǎng)箱養(yǎng)殖、增殖放流等提供了一些合理的建議。

美國紅魚Sciaenops ocellatus是我國網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類中的主要經(jīng)濟魚種[11]。關于美國紅魚的流速研究已有相關報道[12]。但是，關于流速脅迫對美國紅魚肝臟轉(zhuǎn)錄組影響的研究鮮有報道。該試驗主要探究了美國紅魚的肝臟轉(zhuǎn)錄組在最大續(xù)航游泳速度下的變化。本實驗結(jié)果為美國紅魚的養(yǎng)殖海區(qū)選址提供了一定的參考依據(jù)，并進一步完善了流速對美國紅魚肝臟轉(zhuǎn)錄組的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

美國紅魚購于舟山岱山縣養(yǎng)殖基地，并于實驗室暫養(yǎng)2周，以適應實驗室環(huán)境。挑選規(guī)格相近，活力較好的美國紅魚作為實驗對象。實驗室海水為天然海水，并經(jīng)過過濾沉淀，用次氯酸鈉消毒并曝氣。實驗過程中，實驗水溫20～21℃；海水鹽度27～28；水中溶解氧大于7.0 m·L-1，實驗光源為自然光。實驗美國紅魚總計 25 尾，體長 31.5～33.8 cm，體重 501.3～589.0 g。避免測量基礎數(shù)據(jù)對實驗魚的影響，基礎數(shù)據(jù)測量均是實驗結(jié)束后進行。實驗全程用攝像機攝像實時監(jiān)控，以此確定實驗魚的游泳時間，并避免人為因素干擾。

1.2 美國紅魚肝臟轉(zhuǎn)錄組的測序

實驗前對實驗水槽的參數(shù)與性能進行校正并測定該規(guī)格美國紅魚的最大續(xù)航游泳速度，標定實驗流速為0.9 m/s。實驗前將美國紅魚放入水槽中進行低流速的適應，適應流速控制在0.2 m·s-1左右，適應時間為1 h[13]。將實驗組(T01)的適應流速均勻加速到0.9 m·s-1，通過視頻監(jiān)控軟件遠程監(jiān)控實驗魚，避免人為因素影響實驗魚的游泳狀態(tài)，實驗魚觸網(wǎng)20 s以上即視為達到疲勞，結(jié)束實驗[14]。對照組(T02)美國紅魚規(guī)格與實驗組基本一致，控制實驗流速為0 m·s-1。

1.2.1 采樣與處理

實驗結(jié)束后立即撈出實驗魚，并在無菌操作臺迅速解剖獲得肝臟，放入液氮中冷凍，保存至-80℃冰箱中。根據(jù)Tiangen的要求，提取肝組織的RNA(Trizol法)。RNA完整性檢測(1%瓊脂糖凝膠電泳法)；RNA純度檢測(NanoPhotometer法)；RNA濃度檢測(Qubit?)；RNA完整性的評估(NA Nano 6000 Assay Kit of the Agilent Bioanalyzer 2100)[15]。

1.2.2 構建 RNA 文庫

檢測樣品完畢并合格后，啟動RNA文庫構建，在Illumina平臺HiSeq 2500開始測序[16]。cDNA文庫的構建和測序由測序公司完成。

1.2.3 生物信息學分析

為了得到較高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，需要對所得數(shù)據(jù)進行過濾從而降低數(shù)據(jù)噪音。同時去除堿基質(zhì)量低于10，堿基數(shù)低于4和堿基質(zhì)量低于13，堿基數(shù)不高于6的序列；刪除無插入片段序列、palyA序列、長度小于15 nt的小片段序列、5′或3′接頭污染序、列插入片段過長的序列。確保測序的可靠性。經(jīng)過上述處理，獲取干凈序列(clean reads)。

2 實驗結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測序共計獲得9.32Gb Clean Data，兩組樣品Clean Data 均達到 4.54 Gb，Q30 堿基百分比在 92.12% 及以上。De novo拼裝后共獲得70 148條Unigene，其中長度在1 kb以上的Unigene有12 465條。對Unigene進行功能注釋，包括與 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對，共獲得31 704條Unigene的注釋結(jié)果。具體的統(tǒng)計信息如圖1與表1。

圖1 Unigene長度分布圖Fig.1 The length distribution map of Unigene

表1 組裝結(jié)果統(tǒng)計表Tab.1 The assembly results

2.2 SSR分析

分析檢測組裝得的70 148條基因共得到SSR標記10 214個，同時單堿基(Mono-nucleotide)重復個數(shù)至多為6 052個，六堿基(Hexa-nucleotide)重復至少為2個(表2)。同時發(fā)現(xiàn)雙堿基對與三堿基對也出現(xiàn)重復，其中AC/GT，共有重復1 685個；AGG/CCT，重復404個。

表2 重復堿基的長度和數(shù)量的分布Tab.2 Length and number distribution of SSRs based on the number of repeat units

2.3 SNP分析

通過對實驗樣品的SNP分析檢測發(fā)現(xiàn)：實驗組T01和對照組T02的純合型數(shù)目分別為38 020和29 627，雜合型SNP數(shù)目分別為57 835和66 088個(表3)。

表3 SNP數(shù)量統(tǒng)計表Tab.3 Statistics of SNP number

2.4 基因表達分析

通過Bowtie5[17]將實驗樣本所測定的reads與基因庫比較，同時和RSEM5[18]對比，并進行表達量水平的評價?；蜣D(zhuǎn)錄本的豐度表示為FPKM。總體看，基因片段(編碼蛋白質(zhì))經(jīng)過測序得到的基因轉(zhuǎn)錄本的豐度值跨度很大[19]，詳細如圖2所示。

圖2 兩樣品FPKM密度分布對比圖Fig.2 The comparison of FPKM density in two samples

對樣品T01與樣品T02進行了差異表達分析，默認將FDR<0.01且差異倍數(shù)(兩樣品間表達量的比值)≥2作為篩選標準[20]。篩選后得到1 773個顯著性差異表達基因，包括204個上調(diào)基因和969個下調(diào)基因。

繪制兩組樣品基因表達差異的火山圖，圖上坐標點各表示1個表達基因，圖中的橫坐標表示兩組樣品的差異性表達倍數(shù)的對數(shù)值，隨著差異表達倍數(shù)的對數(shù)值的線性增加，其絕對值也增大；圖中縱坐標表示錯誤發(fā)生率的負對數(shù)值，差異表達性決定其數(shù)值，差異表達越大，數(shù)值越大。將差異表達基因進行統(tǒng)計，無顯著性表達差異的基因用紅色表示(FALSE)，顯著性表達的差異基因用綠色表示(TURE)，如圖3所示。

圖3 樣品T01和樣品T02間差異表達基因火山圖Fig.3 The Differentially expressed gene volcanic map between T01 and T02

2.5 差異表達基因聚類分析

通常，具有相似表達模式的基因其功能上也存在較高的相似性。因而，通過MySQL Cluster，對兩組數(shù)據(jù)的表達模式進行聚類分析。如圖4所示，左側(cè)代表試驗組T01的基因表達，右側(cè)代表對照組T02的基因表達，行表示基因表達量(用6種不同顏色表示不同表達量FPKM)。此圖說明兩個樣本存在相似表達模式的基因同時其功能上也存在較高的相似性。

圖4 樣品T01和樣品T02間差異表達基因聚類圖Fig.4 Cluster analysis of differentially expressedn genes in T01 and T02

2.6 差異表達基因GO功能富集

GO富集的分析結(jié)果說明了在流速脅迫下，美國紅魚應對脅迫所表達的生物過程。富集分析發(fā)現(xiàn)，生物過程、細胞組分和代謝過程3組，總計高達424個富集到生物過程中，其中有90個富集到細胞組分中，310個富集到分子功能。在實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，總計有80個差異基因富集在代謝過程上；氧化還原過程(oxidation-reduction process)和負調(diào)節(jié)肽鏈內(nèi)切酶的活動(negative regulation of endopeptidase activity)顯著性富集；在細胞組分上，細胞類別上共有90個差異表達基因富集，其中發(fā)現(xiàn)顯著性富集的有胞外區(qū) (extracellular region)和細胞外間隙(extracellular space)；此外有310個差異表達基因富集到分子功能類別上，實驗發(fā)現(xiàn)只有一個內(nèi)肽酶抑制活性(endopeptidase inhibitor activity)存在顯著性富集。

實驗樣本T01和對照樣本T02間差別表達基因以及全部檢測的基因在GO二級Term的詳細解釋結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，GO各功能位于不同差異表達基因和所有基因兩個背景下的處所，從圖中發(fā)現(xiàn)紅色柱體與藍色柱體具有明顯差別的Term也許和差異有關。

圖5 差異表達基因的GO分類Fig.5 Gene Ontology classifications of differentially expressed genes

2.7 差異表達基因KEGG注釋

生物體的統(tǒng)一性由大量差別基因配合調(diào)節(jié)，彼此作用。不同基因行駛不同功能，各司其職。我們進行了基因差異性表達的Pathway注釋分析去認識各個基因的差異功能。將得到的Pathway和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進行對比。實驗數(shù)據(jù)表明，共有1 096個基因數(shù)差異表達；發(fā)現(xiàn)423條基因被注釋到KEGG通路上。其中富集到新陳代謝通路、環(huán)境信息處理和細胞過的差異表達基因比較多，分別為136、69和67條。分析這423條代謝通路發(fā)現(xiàn)有4條代謝通路顯著富集(Qvalue≤0.05)，分別參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine，serine and threonine metabolism)(p=0.000 9)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)(p=0.0036)、視黃醇的代謝(retinol metabolism)(p=0.003 6)和類固醇類的生物合成(steroid biosynthesis)(p=0.030 3)，具體如圖 5 所示。

2.8 與運動生理相關的差異表達基因

對差異表達基因的KEGG代謝通路富集分析，得到了美國紅魚應對流速脅迫的一些相對基因。如Hedgehog 信號通路(Hedgehog signaling pathway)中 Hh、PKA、CK1、Wnt等基因表現(xiàn)為上調(diào)、RNA 降解(RNA degradation)中的Dcp1、EDC3基因表現(xiàn)為下調(diào)，而TOB基因則表現(xiàn)為上調(diào)；甾類激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)過程中的 17beta-estradiol 17-dehydrogenase酶、testosterone 17beta-dehydrogenase(NADP+)酶會表現(xiàn)下調(diào)，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(glucuronosyltransferase)等酶表達量會表現(xiàn)上升、組氨酸的代謝(histidine metabolism)過程中的 aldehyde dehydrogenase(NAD+)、組氨酸解氨酶(histidine ammonia-lyase)、天冬酰轉(zhuǎn)移酶(aspartoacylase)表達量會表現(xiàn)上升。通過GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析，得到了美國紅魚在流速脅迫下與運動和疲勞有關的基因，同時對比了在脅迫下與正常情況下這些基因在肝臟中表達的不同。具體實驗結(jié)果如表4。

表4 根據(jù)GO和KEGG信號通路富集分析游泳相關的差異表達基因Tab.4 According to GO and KEGG signaling pathways to analyzed the swimming related differentially expressed genes

圖6 前20個差異表達基因信號通路富集Fig.6 Scatter chart of top 20 pathway enrichment of differentially expressed genes

2.9 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的驗證

為了驗證RNA-seq分析的表達譜，對11個基因進行了相關mRNA水平上qPCR測定。這些基因的表達數(shù)據(jù)和通過RNA-seq和qPCR檢測到的轉(zhuǎn)錄亞型見表5和圖7。這些基因和轉(zhuǎn)錄本的表達，均通過qPCR得到證實。經(jīng)過Spearman的rho測試發(fā)現(xiàn)qPCR數(shù)據(jù)之間顯著相關(R2=0.979 7)。根據(jù)qPCR及RNA測序的數(shù)據(jù)，上調(diào)和下調(diào)基因均非常吻合。

表5 RT-PCR和RNA-Seq的對比驗證結(jié)果Tab.5 Comparisons between RNA-Seq data and RT-PCR results

3 討論與分析

本實驗發(fā)現(xiàn)，美國紅魚的游泳能力很強，與王萍等[21]的研究結(jié)果基本一致。在分子方面，美國紅魚無參考基因[22-23]，從基因上研究流速脅迫對其的影響機制仍不明確。本文采用Nanordrop、Qubit2.0、Aglient2100 方法對 RNA 樣品進行分析。測序總共獲得9.32Gb Clean Data，各樣品 Clean Data 均達到 4.54 Gb，Q30堿基百分比在92.12%及以上。De novo組裝后共獲得70 148條Unigene。其中長度在1 kb以上的Unigene有12 465條。本次樣品測序效果較好，文庫構建成功可用，同時進行基因結(jié)構注釋、基因表達量分析和基因功能注釋等一系列生物信息分析，為今后有關美國紅魚功能基因研究提供了寶貴的資源與數(shù)據(jù)庫。

圖7 用RT-PCR驗證的結(jié)果Fig.7 Validation of RNA-seq data using qPCR

相關文獻發(fā)現(xiàn)，在其它脅迫下，如溫度、鹽度、pH、重金屬等會使魚類的基因表達產(chǎn)生巨大的差異[24-25]。本試驗中，通過差異基因的分析發(fā)現(xiàn)，在流速脅迫的下，美國紅魚試驗組有大量顯著性差異表達的基因。經(jīng)過篩選后獲得顯著差異表達的基因有1 773個，其中上調(diào)的基因數(shù)量為204個，下調(diào)的基因數(shù)目為969個。這些差異表達的基因與許多重要的過程和途徑相關，如糖的代謝、RNA剪接、蛋白質(zhì)的分解代謝、核糖體合成、剪接體等。該研究結(jié)果對魚類應對流速脅迫的特異信號網(wǎng)絡的進一步探究具有十分重要的意義。

在生物過程中，富集差異基因最多的為代謝過程，顯著性富集的類別是氧化還原過程和負調(diào)節(jié)肽鏈內(nèi)切酶的活動，內(nèi)肽酶抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境脅迫下，植物的氨基酸和糖類的代謝受到顯著影響[26]。在相關實驗中發(fā)現(xiàn)美國紅魚的游泳疲勞主要與肝糖原相關[12]。這些差異表達基因的發(fā)現(xiàn)，能從分子層次說明美國紅魚在持續(xù)游泳200 min內(nèi)主要進行有氧呼吸，但是高強度的持續(xù)游泳，魚體內(nèi)的的糖類得不到有效補充，從而發(fā)生了糖的異生作用。氧化還原過程直接決定細胞衰老和影響蛋白質(zhì)的功能[27-29]。細胞組分方面，胞外區(qū)和細胞外間隙的顯著性富集說明美國紅魚在運動過程中，伴隨著劇烈的物質(zhì)交換，物質(zhì)跨膜運輸頻繁。內(nèi)肽酶[30-31]在植物中決定著植物葉片的老化，在動物中對動物的造血系統(tǒng)[32]、呼吸功能[33]等有著一定的調(diào)節(jié)作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)在分子功能類別中，內(nèi)肽酶抑制活性基因有顯著性富集，因此推測在流速脅迫下，美國紅魚的造血系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)受到一定的影響，具體的機理尚未明確。應激信號的檢測及其細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導是在各種環(huán)境脅迫下生物的適應和生存的關鍵。關于魚類應對流速脅迫信號并觸發(fā)細胞內(nèi)的反映機制的信息是極為稀缺的。在本研究中，Hedgehog信號通路中Hh、PKA、CK1、Wnt等基因表現(xiàn)為上調(diào)、RNA降解(RNA degradation)中的Dcp1、EDC3基因表現(xiàn)為下調(diào)，而TOB基因則表現(xiàn)為上調(diào)。在老鼠的研究中，TOB基因特異性表達于大鼠的海馬和小腦，其與大鼠的運動協(xié)調(diào)性有關[34]。

在早期分的化斑馬魚肌細胞中，Hh信號能控制快慢肌之間的命運選擇[35]。除了調(diào)節(jié)早期二元態(tài)(慢與快纖維類型)細胞命運的決定，Hh信號還誘導這些譜系中不同類型的細胞生成(肌肉祖細胞、慢肌纖維的子集、內(nèi)側(cè)快肌纖維和快肌纖維的子集)[36]。在美國紅魚持續(xù)游泳過程中，推測Hh信號將誘導慢纖維的生成。同時肌節(jié)分化需要神經(jīng)管中的Shh和Wnt信號，Wnt信號在胚胎生肌過程中發(fā)揮重要作用，且Wnt與Shh相互合作誘導肌節(jié)形成[37]。在成熟成骨細胞中，Hedgehog信號通路活性增強將上調(diào)細胞內(nèi)甲狀旁腺激素相關蛋白的表達量，通過PKA等信號調(diào)控軸促使環(huán)磷酸腺苷應答元件結(jié)合蛋白與RANKL基因增強子結(jié)合，促進RANKL基因表達，促使破骨前體細胞分化為成熟的破骨細胞，進而增強骨吸收活動[38]，從而進一步提高美國紅魚的游泳能力。

甾類激素是一類脂溶性激素，它們在結(jié)構上都是環(huán)戊烷多氫菲衍生物，普遍存在于動植物細胞之中[39]。甾類激素生物合成過程中的17beta-estradiol 17-dehydrogenase酶、testosterone 17beta-dehydrogenase(NADP+)酶會表現(xiàn)下調(diào)，說明美國紅魚在游泳過程中，糖的氧化受到抑制，迫使血液中的糖持續(xù)升高，另一方便又促進蛋白質(zhì)等非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖(糖的異生作用)。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)是重要的II相代謝酶，在大鼠和水牛[40-41]的研究中發(fā)現(xiàn)，肝片吸蟲感染的肝臟中UGT的活性均有不同程度的下降。在魚類中，卻是鮮有研究。本文中的(UGT)等酶表達量會表現(xiàn)上升組，其中具體原因還需進一步驗證。組胺1型受體[42]主要分布于內(nèi)皮和平滑肌等多種細胞，對于血管擴張有一定的促進作用[43]。本實驗中發(fā)現(xiàn)在組氨酸的代謝過程中的Aldehyde dehydrogenase(NAD+)、組氨酸解氨酶、天冬酰轉(zhuǎn)移酶表達量會表現(xiàn)上升，說明在組氨酸脫羧酶的作用下，組氨酸脫羧形成組胺，在高強度的游泳過程中，迫使血管急速擴張，體內(nèi)物質(zhì)交換加速，血液循環(huán)加快。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)流速脅迫對美國紅魚肝臟轉(zhuǎn)錄組存在很大的影響。進一步的分析發(fā)現(xiàn)很多與運動生理相關的編碼如RNA剪切、核糖體真核生物核糖的體合成、蛋白質(zhì)的分解代謝、剪接、蛋白酶和RNA的運輸?shù)闹匾M成的蛋白質(zhì)的基因。具體作用機理還需要進一步深入研究討論。