宋孝鵬

洛陽北方企業(yè)集團有限公司職工醫(yī)院內(nèi)科(河南 洛陽 471000)

腦梗死是因急性缺血、缺氧導(dǎo)致的局部或彌漫性腦組織損傷的血管性事件，發(fā)病率和致死率位列我國前三[1]。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)凝血和抗凝系統(tǒng)平衡失調(diào)在腦梗死發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的促進作用[2]。

血漿抗凝血酶(AT-Ⅲ)是具有絲氨酸酶抑制活性的糖蛋白，可調(diào)節(jié)血漿生理性凝血功能[3]。相關(guān)研究顯示，炎癥與凝血系統(tǒng)之間存在明顯相互作用，促炎因子是主要橋梁[4]。本研究通過檢測110例腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性和TNF-α、IL-6水平，探討其在腦梗死病情發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2016年3月至2017年10月間本院神經(jīng)內(nèi)科收治的腦梗死患者110例為研究組。均經(jīng)CT或MRI確診為腦梗死，NIHSS評分>2分，從發(fā)病到采集血標(biāo)本的時間間隔≤48h。其中男性70例，女性40例，年齡32～81歲，平均(65.38±9.72)歲。選取同期在本院體檢的健康人群110例為對照組，其中男性60例，女性50例，年齡30～78歲，平均(64.51±6.93)歲。兩組受試者一般資料間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均簽署知情同意書，且排除1個月內(nèi)有手術(shù)史、外傷史、口服避孕藥，合并腎病綜合征、血液系統(tǒng)疾病、肝病的受試者。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本采集與制備

抽取受試者清晨空腹肘靜脈血，部分全血用于分離外周血單核細胞，具體為：Hanks液稀釋1倍后加入淋巴細胞分離液，收集單核細胞層，用含血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×1010/L；加入96孔板中，200μL/孔，培養(yǎng)過夜，棄去懸浮細胞，貼壁細胞為單核細胞。另取3.6mL全血加入枸櫞酸鈉0.4mL抗凝管中，離心收集血漿，測定AT-Ⅲ活性；取肝素抗凝血漿，分別檢測免疫復(fù)合物、THF-α、IL-6以及常規(guī)生化項目。

1.2.2 血生化指標(biāo)檢測

邁瑞普利生全自動血凝儀C2000-A檢測AT-Ⅲ活性，配套試劑(凝血酶、底物、凝血酶溶劑)購于上海威奧生物科技有限公司。全自動生活分析儀檢測空腹血糖、血脂四項、同型半胱氨酸水平。使用EIA試劑盒檢測血漿免疫復(fù)合物水平，Elisa法檢測血漿TNF-α、IL-6水平，試劑盒購于上海仁捷生物科技有限公司。

1.2.3 單核細胞數(shù)量和表型檢測

取對數(shù)期單核細胞，緩沖液重懸細胞，分別經(jīng)CD14、CD16、CD32、CD64單克隆熒光抗體染色，上流式細胞儀檢測單核細胞數(shù)量和表型。使用GraphPadPrsim5軟件定量分析單核細胞表面分子表達情況。

1.2.4 免疫復(fù)合物刺激單核細胞后TNF-α、IL-6檢測

12孔板中加入1mL人類IgG孵育過夜，磷酸緩沖液洗滌后，與800μL的小鼠抗人IgG共孵育60min。制備好的孔板加入外周血單核細胞之前用磷酸緩沖液洗滌。將單核細胞加入不同濃度Ig-IC復(fù)合物(0～1000mg/L)的12孔板中培養(yǎng)16h，離心取上清液，Elisa法測定TNF-α、IL-6濃度，以人類IgG為對照。

2 結(jié)果

2.1兩組患者血漿AT-Ⅲ活性水平及臨床資料比較 研究組患者血漿AT-Ⅲ活性為(85.83±9.26)%，低于對照組的(98.24±10.52)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組患者TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.2血漿AT-Ⅲ活性與腦梗死危險因素的相關(guān)性分析 將血壓、空腹血糖、血脂指標(biāo)、同型半胱氨酸為自變量，血漿AT-Ⅲ活性為因變量，進行線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性與收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈負(fù)相關(guān)(r=-0.29、-0.46、-0.38、-0.86、-0.72、-0.91，P<0.05)；與HDL-C呈正相關(guān)(r=0.57，P<0.05)。

2.2血漿免疫復(fù)合物及TNF-α、IL-6水平比較 研究組血漿免疫復(fù)合物水平為高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；研究組TNF、IL-6水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組血漿免疫復(fù)合物及TNF-α、IL-6水平比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.3外周血單核細胞表面標(biāo)志物水平比較

流式細胞術(shù)檢測顯示，CD14+CD16+、CD14+CD32+單核細胞比例在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組CD14+CD64+單核細胞比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血單核細胞表面標(biāo)志物水平比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.4免疫復(fù)合物刺激對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響 加入的Ig-IC復(fù)合物濃度在0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L時外周血單核細胞TNF-α、IL-6的分泌量均隨著Ig-IC復(fù)合物濃度的增加而提升。見表4。

表4 免疫復(fù)合物刺激對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響

3 討論

腦梗死發(fā)病過程中，血管病變引發(fā)內(nèi)膜損傷形成潰瘍，血小板等血液中有形成份聚集并釋放出促凝因子，同時膽固醇、脂蛋白等含量增加，導(dǎo)致血粘度升高，血流速變慢，腦組織出現(xiàn)局部缺血癥狀。因此，腦梗死的發(fā)生與凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)平衡失調(diào)有關(guān)。AT-Ⅲ為肝臟合成的糖蛋白，具有絲氨酸酶抑制活性，作用于多種含絲氨酸酶凝血因子的活性中心，是體內(nèi)抑制凝血的關(guān)鍵物質(zhì)，維持抗凝和纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，約占血漿抗凝血酶活性的60%[5]。本研究中腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性下降，與凝血功能亢進及相關(guān)酶大量消耗有關(guān)。腦梗死危險因素與血漿AT-Ⅲ活性相關(guān)性分析顯示，血壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)，提示血漿AT-Ⅲ活性檢測有助于腦梗死病情防治。近年來大量研究顯示，炎癥與凝血系統(tǒng)存在明顯關(guān)聯(lián)，其中促炎因子發(fā)揮重要橋梁作用[6]。TNF-α多由T細胞、巨噬細胞分泌，參與局部炎癥反應(yīng)，在凝血系統(tǒng)激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；IL-6是可激活凝血系統(tǒng)的促炎因子。本研究顯示，腦梗死患者血漿TNF-α、IL-6水平高于健康對照組，可能與血漿AT-Ⅲ活性下降有關(guān)。炎癥反應(yīng)是腦組織血管硬化斑塊形成的主要病理基礎(chǔ)[7-8]。組織病理學(xué)檢查顯示，斑塊中存在巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞的相互作用，在動脈硬化及斑塊不穩(wěn)定性炎癥過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。本研究中也發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿病理產(chǎn)物的免疫復(fù)合物水平明顯高于對照組，為進一步分析細胞因子和免疫反應(yīng)在腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性變化中的作用，本研究分離了患者外周血單核細胞，檢測其表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，研究組CD14+CD64+單核細胞比例高于對照組，提示腦梗死患者體內(nèi)免疫復(fù)合物可能通過結(jié)合CD14+CD64+單核細胞，分泌大量促炎細胞因子，改變AT-Ⅲ活性。為進一步驗證上述結(jié)論，探討AT-Ⅲ在腦梗死患者中變化的機制，本研究在體外模擬了免疫復(fù)合物，觀察不同濃度免疫復(fù)合物對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響，結(jié)果顯示，隨著免疫復(fù)合物濃度的增加，TNF-α、IL-6分泌水平明顯升高，提示血液中受刺激的單核細胞是腦梗死患者體內(nèi)高水平的促炎因子的主要來源，可不同程度低損傷血管內(nèi)皮細胞，降低抗凝因子合成量，可能為血漿AT-Ⅲ活性降低的原因。

綜上所述，腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性明顯下降，是腦梗死發(fā)生、發(fā)展的危險因素之一，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為腦梗死臨床診治的參考指標(biāo)。其可能機制為免疫復(fù)合物經(jīng)CD14+CD64+單核細胞介導(dǎo)促炎因子分泌，損傷血管內(nèi)皮細胞，抑制AT-Ⅲ合成。