李文梅 賈慶春 崔佳增 王猛 劉夢琪 張晨 路慧 許慧杰 劉世國

摘 要：目的：探討剛地弓形蟲感染與去勢對小鼠血清激素水平的影響。方法：7周齡雌性小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組、去勢組、剛地弓形蟲感染組、剛地弓形蟲感染+去勢組，無菌手術(shù)摘除雌性小鼠雙側(cè)卵巢去勢。F3和F4組小鼠灌胃感染弓形蟲PRU株包囊。60天后采用抗弓形蟲IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒檢測血清弓形蟲特異性IgG抗體、Morris水迷宮定位定航與空間探索實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的改變，ELISA法檢測小鼠外周血雌激素水平。結(jié)果：ELISA檢測小鼠血清抗弓形蟲IgG抗體證實弓形蟲感染組陽性率為100%。隱性弓形蟲感染的去勢小鼠外周血性雌激素水平較去勢小鼠外周血雌激素水平顯著升高（P<0.05）。感染組小鼠外周血雌激素較正常對照組小鼠外周血雌激素水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：隱性弓形蟲感染能使去勢小鼠外周血雌激素水平升高。

關(guān)鍵詞：去勢 弓形蟲 外周血雌激素水平

中圖分類號：Q-06 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2019）04-0-01

弓形蟲是人和溫血類動物常見細胞內(nèi)感染寄生原蟲，其慢性感染可導(dǎo)致動物及人類思維和行為改變[1，2]。外周血性激素水平的恒定是機體生理機能及思維活動正常的根本基礎(chǔ)，性激素水平下降與腦功能狀態(tài)密切相關(guān)[3-5]，而思維遲緩，焦躁、抑郁、和學(xué)習(xí)記憶功能減退是弓形蟲感染的重要臨床特征[6，7]。本研究設(shè)計了去勢動物模型，探討隱性弓形蟲感染對去勢小鼠外周血雌激素水平的影響。

一、材料與方法

1.實驗動物分組

NIH小鼠，健康，清潔級，8周齡雌小鼠40只，體重（20±2）g，購自河南新鄉(xiāng)華蘭生物，常規(guī)飼養(yǎng)。小鼠隨機分為正常對照組、去勢組、感染組、去勢+弓形蟲感染組，每組各10只。適宜性飼養(yǎng)1周后行去勢手術(shù)。術(shù)后一周用灌胃予以感染組和去勢+感染組含有弓形蟲包囊（4～5只包囊）的生理鹽水0.2ml，正常對照組和去勢組予以生理鹽水。

2.試劑

戊巴比妥鈉與抗弓形蟲IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒，雌二醇試劑盒購自江萊生物公司。

3.儀器

分析天平，鼠稱，電熱控溫烤箱，醫(yī)用手術(shù)剪，醫(yī)用鑷子，醫(yī)用手術(shù)刀，水迷宮。

4.實驗方法

4.1去勢小鼠模型建立

1%戊巴比妥鈉（0.35ml/Kg）麻醉后小鼠，腹位固定，取背部中線下1/3處兩側(cè)切口，剪除長毛，沿背部后正中線作一長約0.5-1.0cm的皮膚切口，查找小鼠左右雙側(cè)卵巢，結(jié)扎血管，行卵巢切除術(shù)。

4.2慢性弓形蟲感染去勢小鼠模型建立

每只去勢小鼠經(jīng)口灌胃方法感染弱毒株剛地弓形蟲包囊4～5只。弓形蟲感染2月后采集尾部血液，ELISA方法檢測血液抗弓形蟲抗體。

4.3小鼠行為學(xué)實驗

在去勢60天后，在水迷宮實驗環(huán)境下飼養(yǎng)2d，訓(xùn)練在每天上午8：00～19：00間進行。將Morris水迷宮均分為4個象限（水溫21℃），平臺放入其中1個象限中，沒入水面1cm。小鼠自第1象限面向池壁入水，視頻跟蹤并記錄找到平臺所需時間（潛伏期）。允許在60s內(nèi)找到平臺，找到后在平臺上保持10s。若60s內(nèi)找不到，則引導(dǎo)小鼠到平臺上保持10s。按照上述方法每天每只小鼠在4個象限依次訓(xùn)練一次。5d后撤掉平臺進行探索試驗，記錄小鼠300s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)。

4.4外周血雌激素檢測

小鼠斷尾取血0.25ml，按試劑盒說明進行雌激素水平檢測。

5.統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0軟件，所有數(shù)據(jù)用采用均數(shù)±標準差（X±S）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.慢性弓形蟲感染對去勢小鼠定位定航能力的影響

ELISA檢測小鼠血清抗弓形蟲IgG抗體證實弓形蟲感染組陽性率為100%。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，去勢組逃避潛伏期較正常對照組延長，感染組和去勢+感染組小鼠的潛伏期均較對照組縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.四組小鼠血清性激素水平比較

去勢+感染組的雌激素水平較對去勢組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），感染組的激素水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

三、討論

弓形蟲以人類和動物為中間宿主，貓和其他貓科動物是弓形蟲的終宿主，人類后天感染多因攝入帶有弓形蟲包囊的肉類或有卵囊污染的水源所致。雌二醇（E2）保護神經(jīng)系統(tǒng)，促進突觸重塑及神經(jīng)生長，并調(diào)節(jié)各種和認知相的突觸標記物，增加基底前腦和海馬中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達的功能[8，9]。雌二醇可能可以調(diào)節(jié)BDNF的轉(zhuǎn)錄[8]。通過水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)去勢小鼠逃避潛伏期延長，說明雌激素下降或缺失影響小鼠的記憶認知功能，感染弓形蟲初期小鼠逃避潛伏期縮短，小鼠雌激素卻升高，證實了雌激素通過調(diào)節(jié)腦部與學(xué)習(xí)、記憶、行為相關(guān)因子從而影響腦的功能狀態(tài)，但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)隨著弓形蟲感染時間延長，感染及去勢感染小鼠水迷宮逃避潛伏期都明顯延長，說明弓形蟲慢性隱性感染影響腦的功能狀態(tài)。本研究應(yīng)用通過建立去勢動物感染弓形蟲模型探討雌激素水平下降或缺失狀態(tài)下隱性弓形蟲感染對外周血性激素水平的影響，為雌激素下降或缺失情況下慢性、隱性弓形蟲感染對機體腦功能的改變提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]Zhenggang Xiong，Peter W.Laird.COBRA：a sensitive and quantitative DNA methylation assay[J].Nucleic Acids Research，1997，25（12）：2532–2534.

[2]Bosquiazzo V L， Ramos J G，Varayoud J.Mast cell degranulation in rat uterine cervix during pregnancy correlates with expression of vascular endothelial growth factor mRNA and angiogenesis[J].Reproduction，2007，（133）：1045–1055.

[3]Emilia R，F(xiàn)ederica D，Angelis L，etc.Nicotine exposure during adolescence：cognitive performance and brain gene expression in adult heterozygous reeler mice[J].Psychopharmacology，2014（231）：1775–1787.

[4]Andrea F，Vincenzina N，Rosaria A.B-vitamin deprivation induces hyperhomocysteinemia and brain S-adenosylhomocysteine， depletes brain S-adenosylmethionine， and enhances PS1 and bace expression and amyloid-β deposition in mice[J].A.Fuso et al./Mol. Cell. Neurosci，2008， （37）：731–746.

[5]Marija Kundakovic，Ying Chen， Erminio Costa. DNA Methyltransferase Inhibitors Coordinately Induce Expression of the Human Reelin and Glutamic Acid Decarboxylase 67 Genes[J].Molecular Pharmacolgy，2007，（71）：644–653.

[6]Sophie La Salle，Carmen Mertineit， Teruko Taketo.Windows for sex-specific methylation marked by DNA methyltransferase expression profiles in mouse germ cells[J].Developmental Biology ，2004，（268）：403 – 415.

[7]Jaroslav Flegr，Jan Havlícek，Petr Kodym. Increased risk of traffic accidents in subjects with latent toxoplasmosis： a retrospective case-control study[J].BMC Infectious Diseases，2002，（2）：11

[8]OY Kusbeci，Miman， M Yaman.OC.Could Toxoplasma gondii have any role in Alzheimer disease[J].Alzheimer Disease & Associated Disorders，2011，25（1）：1.

[9]Prandovszky E，Gaskell E，Martin H.The neurotrophic parasite Toxoplasma gondii increases dopamine metabolism[J]. PLoS One， 2011，6： e23866.

作者簡介：李文梅（1985-），女，河南青海互助人，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，主要從事基礎(chǔ)檢驗教學(xué)工作。崔佳增，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2017級研究生。賈慶春，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2015級本科生。劉世國，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子病原體研究室。