李遠闖 富國祥 潘夢雪 郭 強 饒欣欣 徐小雅 周 軼 高建軍 華國強

(復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所放射生物學(xué)部 上海 200032)

結(jié)直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一,其中腸腺癌占絕大多數(shù)[1]。近年來,結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率呈逐年升高趨勢,成為威脅人類健康的重要因素[1-4]。腸腺瘤(adenoma)又稱腺瘤性息肉,是腸道良性腫瘤,有惡變風(fēng)險,被認為是腺癌的早期形式[5-6]。因此從腺瘤出發(fā)研究腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

類器官(organoids)培養(yǎng)是基于體外3D培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來的一種成體干細胞培養(yǎng)體系,能模擬在體器官或特異組織的分化發(fā)育[7]。腸道類器官培養(yǎng)是將分離得到的腸道隱窩或干細胞植入含有多種生長因子的基質(zhì)膠(matrigel)中,在基質(zhì)3D支撐下生成具有腸道上皮樣結(jié)構(gòu)的微型空心球體,并能正常出芽繁殖。該類器官包含所有種類的腸道功能上皮細胞,能最大程度模擬腸道組織,故稱為“迷你腸”[8-9]。除正常腸道類器官外,也可培養(yǎng)結(jié)直腸腺瘤、腺癌等腸道腫瘤類器官[10-11]。

本研究利用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和葡聚糖硫酸鈉(detrain sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)直腸腺瘤。參考小腸類器官培養(yǎng)技術(shù),建立小鼠腺瘤類器官培養(yǎng)方法,觀察電離輻射的作用,以期為基于腺瘤類器官的基因操作及結(jié)直腸腫瘤研究提供參考。

材料和方法

實驗動物、主要試劑和儀器6～8周齡雄性SPF級C57BL/6j小鼠,購自上海南方模式生物科技股份有限公司(合格證號:312024300000732)。

AOM、Ⅸ型膠原酶、N-乙酰半胱氨酸購自美國Sigma公司;透明質(zhì)酸酶購自北京索萊寶科技有限公司;DSS購自美國MP Biomedical公司;Ⅱ型分散酶、B27、N2購自美國Invitrogen公司;EDTA購自美國Ambion公司;DMEM培養(yǎng)基、改良型DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、HEPES、GlutMax、雙抗(青霉素/鏈霉素)購自美國Gibco公司;EGF、R-spondin1、Noggin購自北京義翹神州科技有限公司;基質(zhì)膠購自美國Corning公司;兔抗Ki-67抗體、抗β-catenin抗體購自美國BD Biosciences公司。

超凈臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、低溫離心機(美國Beckman公司);石蠟包埋機、切片機(德國Leica公司);倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)。

結(jié)直腸腺瘤誘導(dǎo)參考文獻[12],小鼠一次性腹腔注射AOM(12.5 mg/kg)。5天后相繼更換飲用水(含2%、1.5%和1%DSS,W/V),每個濃度飲用5天,中間間隔2周正常飲水。至第90天對小鼠進行開腹探查,收集腸腺瘤標本備用。實驗操作符合復(fù)旦大學(xué)實驗動物倫理要求。

腺瘤類器官培養(yǎng)取新鮮小鼠腺瘤標本,于10 cm培養(yǎng)皿中切碎,經(jīng)PBS漂洗后富集于50 mL離心管中,于消化液(DMEM培養(yǎng)基,含1%FBS、500 U/mL Ⅸ型膠原酶、1.5 mg/mL Ⅱ型分散酶)中37 ℃振蕩消化30～40 min。更換PBS,振搖20～30次,并于光學(xué)顯微鏡下監(jiān)測隱窩分離情況。收集分散良好的腺瘤隱窩,用含雙抗PBS漂洗3次,200×g離心5 min,用預(yù)冷的基質(zhì)膠重選,接種于24孔培養(yǎng)板,加入腺瘤培養(yǎng)液(改良型DMEM/F12培養(yǎng)基,含100 ng/mL Noggin、50 ng/mL EGF、1×B27、1×N2、1×雙抗、1×GlutaMax、10 mmol/L HEPES和500 μmol/L N-乙酰半胱氨酸),于5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下進行體外培養(yǎng)。每3天換液1次,期間用倒置相差顯微鏡觀察類器官生長情況,并擇機傳代或凍存。選擇長勢良好的培養(yǎng)孔,棄培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS輕輕吹散基質(zhì)膠,收集懸液,PBS漂洗2次,4 ℃、200×g離心5 min,計數(shù)類器官數(shù)量,用相應(yīng)體積預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸并接種。

小腸類器官培養(yǎng)參考文獻[10],取同周齡小鼠,處死后于胃下2 cm處截取約10 cm空腸腸段。PBS沖洗腸腔,縱向切開并剪成長約0.5 cm的小片段,收集備用。PBS(含雙抗)漂洗,于含5 mmol/L EDTA的PBS中消化40 min(冰浴)。PBS(含雙抗)漂洗,去除絨毛等碎片,更換PBS,振搖后獲得小腸隱窩懸液。過濾后于4 ℃下69×g離心5 min,用預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸并接種,添加小腸類器官培養(yǎng)液(改良型DMEM/F12培養(yǎng)基,含500 ng/mL R-spondin1、100 ng/mL Noggin、50 ng/mLEGF、1×B27、1×N2、1×雙抗、1×GlutaMax、10 mmol/L HEPES和500 μmol/L N-乙酰半胱氨酸),培養(yǎng)和觀察步驟同前。

大腸類器官培養(yǎng)參考文獻[10],取同一小鼠,截取結(jié)直腸約5 cm。PBS沖洗腸腔,縱向切開并剪成長約0.5 cm的小片段,收集備用。PBS(含雙抗)漂洗,于消化液(DMEM培養(yǎng)基,含1%FBS和500 U/mL Ⅸ型膠原酶)中37 ℃水浴中消化30～40 min。PBS(含雙抗)漂洗,去除絨毛等碎片,更換PBS,用力振搖20～30次,獲得大腸隱窩懸液。過濾,4 ℃下69×g離心5 min,用預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸并接種,添加大腸類器官培養(yǎng)液(50%Wnt條件培養(yǎng)液+50%改良型DMEM/F12培養(yǎng)基,含500 ng/mL R-spondin1、100 ng/mL Noggin、50 ng/mL EGF、1×B27、1×N2、1×雙抗、1×GlutaMax、10 mmol/L HEPES和500 μmol/L N-乙酰半胱氨酸)。

免疫組化染色取腺瘤或類器官用4%多聚甲醛4 ℃固定,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片,厚度為5 μm。取石蠟切片脫蠟水化后分別行HE、Ki67和β-catenin染色[13]。Ki67、β-catenin染色前在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)中95 ℃修復(fù)20 min,待冷卻至室溫后以3% 過氧化氫(PBS稀釋)作用10 min,去除內(nèi)源性過氧化物酶。PBST洗片,室溫下10%驢血清封閉1 h,加入兔抗Ki67抗體(1∶500)和β-catenin抗體(1∶200)作為以抗,4 ℃孵育過夜。隔日以PBST洗片,用鼠兔通用型免疫組化顯色試劑盒(基因科技上海股份有限公司)進行二抗孵育和顯色,封片后觀察。

類器官存活實驗將小鼠腺瘤類器官和大、小腸類器官分別傳代接種到48孔細胞培養(yǎng)板,每孔200～300個,24 h后用 X線照射儀(RAD-320,PXI)照射,照射劑量分別為0、3、6、9、12 Gy,照射條件:SSD 50 cm,250 kV,12 mA,劑量率245 cGy/min。繼續(xù)培養(yǎng)7天,顯微鏡下計數(shù)每孔存活類器官數(shù)量:壞死類器官絮團狀輪廓殘影基礎(chǔ)上新生的成球或出芽狀、折光性佳的類器官即判斷為存活類器官(N7),與照前類器官數(shù)(N0)比較,計算類器官存活率(survival rate,SR)。計算公式:SR=(N7/ N0)× 100%。用GraphPad Prism 6.0 軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線。

結(jié) 果

誘導(dǎo)小鼠腸腺瘤經(jīng)AOM/DSS誘導(dǎo)的腺瘤均位于結(jié)腸靠近直腸處,誘導(dǎo)程序見圖1A,肉眼可見結(jié)直腸上皮內(nèi)出現(xiàn)異常增生息肉狀結(jié)構(gòu)(圖1B)。20只小鼠中成瘤19只,成功率為95%,其中腺瘤個數(shù)超過5個的小鼠為14只(圖1C)。

A:Experimental scheme;B:Macrograph images of mouse colon adenomas;C:Number of adenomas developed in mice.

圖1 AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠腸腺瘤
Fig 1 Intestinal adenomas in mice induced by AOM/DSS

取腺瘤組織,經(jīng)HE染色,可見清晰的腺體狀結(jié)構(gòu),腺體周圍細胞核增大(圖2)。經(jīng)Ki67免疫染色顯示,誘導(dǎo)產(chǎn)生的腺瘤具有較高的增殖活力。β-catenin 免疫組化染色結(jié)果顯示,腺瘤細胞β-catenin入核明顯,而腺體周圍的正常組織細胞入核不明顯(圖2)。

A:HE staining(×200);B:Ki67 staining(×200);C:β-catenin staining(×200);D-F:High power fields of A-C(×400).

圖2 小鼠腸腺瘤HE染色和Ki67、β-catenin免疫組化染色結(jié)果
Fig 2 HE staining and immunohistochemical staining for Ki67 and β-catenin of intestinal adenoma in mice

培養(yǎng)腺瘤類器官采用小鼠小腸和大腸培養(yǎng)基對腺瘤組織消化獲得的腺瘤細胞進行3D培養(yǎng)。在小鼠小腸培養(yǎng)基中去除R-spondin1后,小鼠腺瘤類器官球體結(jié)構(gòu)維持良好,生長穩(wěn)定(圖3A)。取該類器官行Ki67和β-catenin免疫組化染色,結(jié)果顯示腺瘤細胞Ki67陽性,且β-catenin入核特征明顯(圖3D、3E)。與腺瘤組織染色結(jié)果一致,表明該類器官仍保留了腺瘤的主要生物學(xué)特征。

A:Adenoma organoids(×50);B:Small intestinal organoids(×50)and its high power field;C-E:HE,Ki67 and β-catenin staining of adenoma organoids(×400).

圖3 小鼠腺瘤類器官及其HE染色和Ki67、β-catenin免疫組化染色結(jié)果
Fig 3 The adenoma organoids of mice and their HE staining,immunohistochenical staining for Ki67 and β-catenin

小腸類器官培養(yǎng)液中不含Wnt3a,導(dǎo)致正常小腸上皮干細胞分化,培養(yǎng)中小腸類器官出現(xiàn)芽狀結(jié)構(gòu)(圖3B);而腺瘤細胞可能存在Wnt通路激活型突變,使得腺瘤類器官仍保持球形增殖狀態(tài),這也與腺瘤細胞β-catenin的高入核率及Ki67的高陽性率結(jié)果相一致。

腺瘤類器官的輻射敏感性體外培養(yǎng)腺瘤類器官和大、小腸類器官,X線照射后受損類器官出現(xiàn)萎縮、塌陷,輪廓逐漸崩解,僅殘留絮團狀殘影。照射后第7天,各類器官存活比例隨輻射劑量增加而降低,其中小腸類器官降低最明顯,9 Gy以上劑量組未發(fā)現(xiàn)存活的小腸類器官(圖4A～4O)。6 Gy和9 Gy劑量組腺瘤類器官存活率分別為24.55%±1.84%和11.96%±1.42%,高于同劑量大腸類器官的16.52%±1.29%(t=6.203 9,P<0.01)和5.46%±1.22%(t=6.008 2,P<0.01)(圖4P)。腺瘤類器官劑量存活曲線較大腸類器官右移,較小腸類器官明顯右移(圖4Q)。

討 論

采用AOM/DSS方法可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生結(jié)直腸腺瘤,與利用APC基因缺失小鼠自發(fā)形成腺瘤[11]比較,此法更為穩(wěn)定且成瘤率高。腺瘤全部位于結(jié)直腸部位,且瘤體體積大,便于手術(shù)完整摘取。從HE染色結(jié)果來看,AOM/DSS誘導(dǎo)的腺瘤具有明顯的腺體狀結(jié)構(gòu),與腺癌的形態(tài)非常接近。AOM/DSS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腺瘤主要涉及WNT通路APC等信號分子的突變[5-6],該突變也常發(fā)生于腺癌早期,可用于結(jié)直腸癌早期發(fā)病機制研究。

為有效分離腺瘤隱窩,Sato等[11]剪取載瘤的腸段,首先于PBS(含2 mmol/L EDTA)中使正常腸上皮細胞脫落,再用膠原酶消化瘤體,收集隱窩。而我們則通過手術(shù)方式直接剝離腺瘤標本,剪切小塊后立即消化,成功獲得腺瘤隱窩,簡便易行。

類器官培養(yǎng)是基于體外3D培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來的一種成體干細胞培養(yǎng)體系,可模擬在體器官或特異組織的分化發(fā)育[7]。腸道類器官培養(yǎng)是將分離的腸道隱窩或干細胞植入含有多種生長因子的基質(zhì)膠中,在基質(zhì)3D支撐下生成具有腸道上皮樣結(jié)構(gòu)的微型空心球體[8]。Wnt通路對腸道上皮干細胞的增殖至關(guān)重要[8-9,14]。小腸干細胞可分化出潘氏細胞,后者可為干細胞增殖提供必要的Wnt配體(如Wnt3a等)[9,14-16],故可在不添加Wnt3a的培養(yǎng)基中生長;而大腸上皮干細胞則在其中無法長期生存,也不能形成類器官。培養(yǎng)基中缺少Wnt3a,也可從小腸類器官的形態(tài)變化中得到側(cè)證,即隨著干細胞分化而出現(xiàn)的芽狀結(jié)構(gòu)。R-spondin是Wnt信號的激動劑,腺瘤細胞由于存在APC等基因突變,其Wnt通路常被激活,不需Wnt3a和 R-spondin也可引起細胞過度增殖,使得腺瘤類器官持續(xù)保持球形增殖狀態(tài)。因此我們選擇在小腸培養(yǎng)基中去除R-spondin1,可以避免大腸干細胞的混雜和干擾。小鼠腺瘤類器官球體結(jié)構(gòu)維持良好,生長穩(wěn)定。經(jīng)Ki67和β-catenin免疫染色結(jié)果證實,腺瘤細胞的高Ki67陽性率和高β-catenin入核率與腺瘤組織染色結(jié)果相一致,表明該類器官仍保留了腺瘤組織的主要生物學(xué)特征。

A-E:Small intestinal organoids 7 days after 0,3,6,9 and 12 Gy of X rays exposure;F-J:Colon organoids after 0,3,6,9 and 12 Gy of irradiation;K-O:Adenoma organoids after 0,3,6,9 and 12 Gy of irradiation(bright field,×200);P:Survival rate of organoids,(1)P<0.01,n=3;Q:Survival curves of organoids post irradiation.

圖4 腺瘤、大腸和小腸類器官的輻射生存反應(yīng)
Fig 4 Survival of adenoma organoids,colon organoids and small intestinal organoids post-irradiation

既往研究表明大腸較小腸對射線更為耐受[13]。給予小鼠腹腔局部15 Gy X線處理后,小腸上皮形態(tài)崩塌,幾乎無隱窩出現(xiàn),而大腸在19 Gy X線作用下,仍可產(chǎn)生新生隱窩。在類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,我們初步觀察了腺瘤類器官對電離輻射的反應(yīng)。6 Gy以上X線照射后,類器官出現(xiàn)萎縮、塌陷,輪廓逐漸崩解,僅殘留絮團狀殘影。照射后第7天,各類器官存活比例隨輻射劑量增加而降低,其中小腸類器官減少更明顯,9 Gy及以上劑量組未發(fā)現(xiàn)存活的小腸類器官,而大腸類器官在9 Gy照射后約有5 %存活,腺瘤類器官則有近12 %的存活率,并且存活的腺瘤類器官具有更完整的形態(tài)。腺瘤類器官劑量存活曲線較大腸類器官右移,較小腸類器官明顯右移,反映其具有更高的輻射耐受水平。本研究中類器官的培養(yǎng)條件不同,大腸類器官采用含Wnt3a的培養(yǎng)基,其對輻射敏感性的影響仍有待研究。

綜上所述,使用AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生結(jié)直腸腺瘤模型的方法穩(wěn)定、高效,由此建立的腺瘤類器官保留了腺瘤組織的主要生物學(xué)特征,可模擬在體腺瘤對電離輻射等干預(yù)的反應(yīng),培養(yǎng)方法可靠實用。以此為基礎(chǔ)的基因操作可為結(jié)直腸腫瘤發(fā)病機制的研究提供基礎(chǔ)。

致謝童順高老師指導(dǎo)X線照射實驗。