嚴華美 趙 琬 張星燦 畢辰辰 楊 瑛

(上海市閔行區(qū)疾病預防控制中心 上海 201101)

2017年上海市報告發(fā)現(xiàn)的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者中,經(jīng)性傳播占96.3%,其中男男同性傳播為57.7%,異性傳播為38.6%,同性傳播已成為上海市HIV-1的主要傳播途徑[1]。男男性行為(men who have sex with men,MSM)人群HIV-1感染率高、隱匿性較強,是HIV-1防治的重點目標人群,相關措施也應根據(jù)其獨有特征來開展。隨著我國抗病毒治療的逐漸深入,在巨大的藥物選擇壓力下,HIV-1耐藥問題已引起廣泛關注[2]。由于MSM的多性伴、高流動性,該人群的HIV-1分子亞型及原發(fā)性耐藥監(jiān)測顯得至關重要。本研究從MSM感染者與一般男性感染者的相關特征比較來探討可能更適宜該人群的防控措施,對HIV-1亞型及耐藥進行分析,為該人群的抗病毒治療策略提供依據(jù)。

資料和方法

研究對象2014年上海市閔行區(qū)疾病預防控制中心艾滋病實驗室新確認的男性HIV感染者中經(jīng)同性感染97名,異性感染26名。對兩者做相關特征比較,從經(jīng)同性途徑感染的樣本中隨機抽出55份進行HIV-1亞型及原發(fā)性耐藥分析。

HIV核酸提取使用德國QIAGEN 公司生產(chǎn)的QIAcube HT cador Pathogen 96 QIAcube HT kit和QIAcube HT Plastic ware及200 μL血漿按照說明書要求提取核酸。

HIV序列擴增使用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及巢式PCR方法擴增HIV的pol基因的蛋白酶編碼區(qū)及逆轉錄酶編碼區(qū),擴增試劑盒使用Takara One Step RNA PCR kit(AMV)和Takara EX Taq [寶生物工程(大連)有限公司],擴增引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,引物詳見表1。反應條件為:第一輪PCR,50 ℃、30 min,94 ℃、2 min,94 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、1 min 30 s,30個循環(huán);72 ℃、10 min,4 ℃保溫;第二輪PCR,94 ℃、1 min,94 ℃、1 min,63 ℃、1 min,72 ℃、2 min,3個循環(huán);94 ℃、30 s,63 ℃、30 s,72 ℃、1 min 20 s,30個循環(huán),72 ℃、10 min,4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物電泳使用毛細管電泳儀QIAxcel DNA 及QIAxcel DNA Screening kit對擴增產(chǎn)物電泳,目的片段約1.2 kb。PCR產(chǎn)物純化和測序委托上海毆易生物科技有限公司完成。

序列整理及分析使用Squencer 4.9 軟件對原始序列進行拼接和編輯。將整理好的序列用Treemaker工具建立系統(tǒng)進化樹并提交至美國拉莫斯國家實驗室HIV核酸序列庫(http://www.hiv.lanl.gov)及美國斯坦福大學的HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.stanford.edu)進行HIV亞型判定及耐藥性分析。本研究對出現(xiàn)潛在低度耐藥及以上水平的耐藥突變進行了統(tǒng)計,判斷依據(jù)2009年WHO的耐藥監(jiān)測突變列表。

統(tǒng)計學分析應用SPSS 18.0軟件,對數(shù)據(jù)采用χ2檢驗進行比較,檢驗水準α=0.05。

結 果

MSM感染者與一般男性感染者相關特征比較2014年閔行區(qū)新發(fā)現(xiàn)的MSM HIV感染者最小17歲,最大74歲,平均年齡(30.6±9.7)歲。一般男性感染者最小24歲,最大77歲,平均年齡(44.1±15.0)歲。將年齡分層后發(fā)現(xiàn),MSM感染者主要集中在25～34歲年齡層(55.7%),一般男性感染者主要集中在≥35歲年齡層(65.4%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.84,P=0.001);MSM人群婚姻狀況以未婚為主(69.1%),一般男性感染者以已婚為主(57.7%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.54,P=0.001);MSM人群文化程度以大專及以上為主(54.6%),一般男性感染者以初、高中為主(69.2%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.32,P=0.006);MSM感染者樣本主要來源于檢測咨詢(60.8%),一般男性感染者主要來源于醫(yī)療機構(50.0%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.03,P=0.002),具體見表2。

表1 HIVpol基因PCR擴增及測序引物Tab 1 PCR primers used for amplification and sequencing of HIV pol

表2 MSM感染者與一般男性感染者相關特征比較Tab 2 The characteristics of infected MSM compared to heterosexual infected male [n(%)]

VCT:HIV voluntary counseling and testing.

HIV-1亞型分析55例樣本共擴增出48條序列,擴增率87.3%。以CRF01_AE亞型為主,共28例(58.3%),其次為CRF07_BC亞型,共10例(20.8%),URF_0107亞型3例(6.3%),B亞型和CRF55_01B各2例,CRF08_BC,URF BC及CRF68_01B各1例。將序列構建進化樹如圖1所示。

圖1 上海市閔行區(qū)48例MSM HIV陽性感染者系統(tǒng)進化樹
Fig 1 Phylogenetic tree analysis of 48 HIV positive MSM from Minhang District,Shanghai

HIV-1原發(fā)性耐藥48條序列中有12條出現(xiàn)耐藥突變位點,其中10條出現(xiàn)潛在低度耐藥,2條出現(xiàn)低度及以上耐藥。NRTI突變位點2個,為V75L和K70R,前者引起D4T、DDI潛在低度耐藥,后者引起AZT中度耐藥,D4T低度耐藥,BC、DDI、TDF潛在低度耐藥;NNRTI突變位點11個,其中V179D/E位點10個,E138G位點1個,前者引起對EFV、ETR、NVP、RPV的潛在低度耐藥,后者引起對EFV、ETR、NVP、RPV的低度耐藥,PIs突變位點1個,為 K20I,引起NFV的潛在低度耐藥。按WHO的耐藥標準,本次耐藥率為4.2%。具體如表3所示。

討 論

MSM人群在我國沿海及北部地區(qū)早已經(jīng)成為艾滋病流行的三大核心人群之一[3]。2014年上海市閔行區(qū)男性新發(fā)HIV感染者中,經(jīng)同性感染占75.2%,為HIV感染的主要途徑。本研究中30.9%的MSM感染者有過婚姻,其高感染率及作為傳播給異性的橋梁人群,使其成為艾滋病防治的重要目標人群。相比一般男性感染者,MSM感染者具有更年輕、文化程度更高、自我檢測意識較強的特點。提示針對MSM的艾滋病防治可以嘗試使用針對性更強的防控措施,如利用互聯(lián)網(wǎng)+促進MSM感染者檢測HIV;通過他們常用的聊天網(wǎng)站傳遞HIV防治信息,進行HIV相關知識互動,定位附近檢測點、治療機構和醫(yī)療服務機構等信息[4-7];使用暴露前、后預防性用藥等[8-9]。

表3 MSM HIV-1感染者耐藥突變位點及耐藥情況Tab 3 The primary drug resistance mutation in HIV-1 infected MSM

本研究中MSM感染者HIV-1亞型仍以CRF_01AE為主,其次為CRF07_BC,這與一些研究[10-12]結果一致。本研究還擴增出3例URF_0107亞型,2例CRF55_01B。URF_0107亞型為CRF_01AE與CRF07_BC亞型的第二代組合亞型,在Li 等[13]研究中有發(fā)現(xiàn)該亞型,CRF55_01B在2012年首次報道,已廣泛散布于我國南部和西北部多個省份[14],為MSM感染者中發(fā)現(xiàn)的一種重組流行亞型[15],說明MSM感染HIV毒株的重組速度快,并可能會陸續(xù)出現(xiàn)多種新的重組毒株,這將導致不同耐藥進化模式的出現(xiàn)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者的潛在耐藥突變位點,主要以V179D/E為主,可引起EFV、ETR、NVP及RPV的潛在耐藥,與其他國內(nèi)外未治療HIV感染者突變位點相似[17]。針對NRTI和NNRTI的耐藥位點各1例,為K70R和E138G,分別出現(xiàn)在B亞型和CRF01_AE亞型,未發(fā)現(xiàn)PI相關耐藥位點,耐藥率為4.2%,目前呈現(xiàn)低度耐藥,這與王緒琴等[11]的研究結果一致。這可能與我國一線藥物主要以NRTI和NNRTI類為主,PI主要作為二線藥物使用等因素相關。說明目前抗病毒治療方案對新發(fā)現(xiàn)感染者仍然適用。但本研究結果略高于閔行區(qū)2013年86例HIV陽性樣本的耐藥研究(耐藥率1.2%)[18]。MSM人群具有高感染率、廣泛擴散及多性伴等特點,應繼續(xù)加強對該人群的HIV分子流行病學監(jiān)測,以及時了解疫情發(fā)展方向,為臨床治療提供相關的客觀依據(jù)。