翁梅琳 王 敬 杜春春 許平波 鐘 靜

(復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科-復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系 上海 200032)

人體對(duì)急性心理社會(huì)應(yīng)激的自然反應(yīng)包括“戰(zhàn)斗或逃跑”的反應(yīng),導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激激素的激活。圍術(shù)期對(duì)腫瘤患者的長(zhǎng)期預(yù)后有重要意義,而患者在圍術(shù)期可能出現(xiàn)明顯的應(yīng)激。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)激激素特別是兒茶酚胺類與卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤進(jìn)展相關(guān)[1]。多個(gè)臨床前研究證實(shí)應(yīng)激引起的兒茶酚胺釋放對(duì)腫瘤的發(fā)生有影響,包括前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等[2-4]。應(yīng)激可能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制[5]。兒茶酚胺可以直接作用于腫瘤組織及其微環(huán)境,通過β腎上腺素能受體(β adrenoreceptor,β-AR)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào),促進(jìn)癌癥的發(fā)展、血管生成和細(xì)胞凋亡[6-7]。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的大腦惡性腫瘤,是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤[8]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)迅速,大多數(shù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在患病后2年內(nèi)腫瘤即進(jìn)展[9],總生存期中位數(shù)為11.2個(gè)月,手術(shù)切除是最主要的治療手段[10-11]。因此膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有較大的可能性要面對(duì)圍術(shù)期應(yīng)激。既往研究主要集中在去甲腎上腺素和前列腺素對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的影響,對(duì)其他激素的研究較少。目前未見應(yīng)激激素腎上腺素對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展影響的報(bào)道。因此,本研究擬通過MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(wound healing assay)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn),探討腎上腺素對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和U251的增殖、遷徙和侵襲的影響。

資料和方法

主要試劑及細(xì)胞株腎上腺素(貨號(hào):E4642)、普萘洛爾(貨號(hào):40543)和transwell實(shí)驗(yàn)所需的結(jié)晶紫(貨號(hào):C0775)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司;鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)單克隆抗體(貨號(hào):ab38898)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗鼠IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Corning?膠原Ⅳ?購(gòu)自美國(guó)Corning公司;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液及新生牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT試劑盒購(gòu)自德國(guó)Carl Roth GmbH & Co.;cDNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR采用美國(guó)Bio-Rad公司iTaq SYBR Green Supermix試劑盒;人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG和U251均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。U251和U87MG細(xì)胞接種在24孔板底部(5×104/孔),加入含有10%FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,加入不含F(xiàn)BS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,并用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50、100 μmol/L)處理24 h;每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)和完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)3 h;去除上清液,每孔加入500 μL二甲基亞砜,震蕩10 min充分溶解。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細(xì)胞為對(duì)照組。最后,使用微孔板分光光度計(jì)測(cè)定570 nm讀數(shù)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)在6孔板中培養(yǎng)U251和U87MG細(xì)胞24 h。24 h后,用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷徙情況。用200 μL的吸管針尖對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行劃痕。將含有細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基吸走,用新鮮無血清培養(yǎng)基代替。分別用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)對(duì)U251和U87MG細(xì)胞進(jìn)行處理,并保存在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。在0 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用顯微鏡評(píng)估劃痕變化情況,沿每個(gè)劃痕標(biāo)記3個(gè)隨機(jī)選擇的點(diǎn),并測(cè)量細(xì)胞遷徙的水平距離。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細(xì)胞為對(duì)照組。

細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定通過transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞侵襲。Corning?BioCoatTM細(xì)胞培養(yǎng)板(24孔,8 μm孔徑)包被0.53 mg/mL Corning?膠原Ⅳ?,并按照說明書在室溫下孵育1 h。將不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基100 μL加入到每孔的上室中,以使上室底部的膜水合,將U251細(xì)胞(5 ×105)懸浮于200 μL不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中,加入到每孔的上室中。下室內(nèi)加入750 μL含5% FBS的培養(yǎng)基。U251細(xì)胞用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)進(jìn)行處理,并在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中保溫24 h。吸出上室內(nèi)培養(yǎng)基,用棉花棒輕輕地擦拭上室底部?jī)?nèi)側(cè)表面,以機(jī)械方式去除上室內(nèi)側(cè)表面的細(xì)胞。遷移至膠原Ⅳ包被的上室下側(cè)面的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色15 min,在200倍顯微鏡下,選取5個(gè)隨機(jī)視野,計(jì)數(shù)侵入細(xì)胞,用Image J計(jì)算5個(gè)視野所得細(xì)胞的平均數(shù)。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細(xì)胞為對(duì)照組。

qRT-PCR以TRIzol-氯仿-異丙醇法提取各細(xì)胞株的總RNA,檢測(cè)含量。按照產(chǎn)品操作說明,以20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃、10 min預(yù)變性,95 ℃、15 s,60 ℃、1 min共40個(gè)循環(huán),以GAPDH的Ct值作為參照,以2-ΔΔCt計(jì)算mRNA倍數(shù)變化,引物序列如表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)使用的腎上腺素能受體和MMP-9引物Tab 1 Primers for adrenergic receptors and MMP-9 detection by qRT-PCR

β-AR:β-adrenergic receptors;MMP:Matrix metalloproteinase.

Western blot檢測(cè)在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)U87MG細(xì)胞株,經(jīng)0.1、1、10、50 μmol/L腎上腺素處理24 h后,收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞,分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解,提取蛋白質(zhì)并定量。取40 μL總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后以8%脫脂奶粉在室溫下封閉 1 h,PBST洗滌3次,在1∶1 000濃度的鼠抗人MMP-9單克隆抗體及1∶5 000濃度鼠抗人GAPDH單克隆抗體中4 ℃搖床過夜,PBST洗滌3次,以1∶5 000濃度的兔抗鼠IgG二抗室溫?fù)u床孵育1 h,顯色。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白質(zhì)水平。

明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9活性U87MG細(xì)胞(1×106/mL)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿,用不同濃度的腎上腺素處理后收集上清液,將5×上樣緩沖液(含0.32% Tris-HCL 6.4 mL,4% SDS 8 mL,16%甘油 3.2 mL,溴酚藍(lán)0.024 g,ddH2O 2.4 mL)添加到上清液中,然后將混合液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離;電泳后,將凝膠放入 1×酶譜復(fù)性緩沖劑(LC2670,美國(guó)Life Technology公司)中輕輕震蕩30 min;然后將凝膠在顯影緩沖液(LC2671,美國(guó)Life Technology公司)中37 ℃孵育24 h,使用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠染色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Sigmaplot 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(不同濃度腎上腺素)間采用單因素方差分析,MMP-9、β-AR mRNA表達(dá)變化以ΔΔCt作為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

腎上腺素促進(jìn)U87MG和U251細(xì)胞增殖使用qRT-PCR檢測(cè)β腎上腺素能受體在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U87MG中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1、β2腎上腺素能受體mRNA在U251和U87MG中均表達(dá),且在U251細(xì)胞中的表達(dá)較在U87MG細(xì)胞高(圖1A)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎上腺素對(duì)U251和U87MG細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果表明:50 μmol/L腎上腺素使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251的增殖能力較對(duì)照組顯著升高(P=0.012 1,圖1B、C)。

腎上腺素促進(jìn)U87MG和U251細(xì)胞遷徙使用腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG和U25124 h后,U87MG和U251細(xì)胞的遷徙能力隨著腎上腺素濃度升高逐漸增強(qiáng);當(dāng)腎上腺素濃度增加到50 μmol/L時(shí),腎上腺素處理24 h后的U87MG細(xì)胞的遷徙能力較0 h顯著升高(P=0.001 4),U251細(xì)胞的遷徙能力也較0 h顯著升高(P=0.002 2);且腎上腺素處理24 h后,U87MG和U251細(xì)胞的遷徙能力均較對(duì)照組顯著升高(P均為0.009 1,圖2)。

圖1 β-AR能受體的表達(dá)情況以及腎上腺素對(duì)U251和U87MG細(xì)胞增殖的影響
Fig 1 β-AR expression in human glioblastoma U251 and U87MG cells and the effects of epinephrine on U251 and U87MG cell proliferation

A:Representative images of U87MG following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×20);B:Distance to be migrated(mm)of U87MG;C:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×100);D:Distance to be migrated(mm)of U251.vs.0 h within group(n= 4),(1)P<0.05;vs.control group(n=4),(2)P<0.05.

圖2 腎上腺素對(duì)U87MG和U251細(xì)胞遷徙的影響
Fig 2 Effect of epinephrine on the migration of U87MG and U251 cells

腎上腺素促進(jìn)U251細(xì)胞侵襲使用腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)處理24 h后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251的侵襲能力隨著腎上腺素濃度升高而增加,當(dāng)腎上腺素濃度增加到50 μmol/L時(shí),U251的遷徙能力顯著高于對(duì)照組(P=0.009 1,圖3A、B)?？梢?腎上腺素和U251細(xì)胞侵襲能力呈劑量依賴性,繪制劑量-效應(yīng)曲線,曲線拐點(diǎn)處的腎上腺素濃度為10 μmol/L(圖3C)。

A:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×200).B:Number of invading glioblastoma cells following treatment with different concentrations of epinephrine for 24 h.C:Dose-effect curve of epinephrine on the invasive ability of U251.vs.control group(n=4),(1)P<0.05.

圖3 腎上腺素對(duì)U251細(xì)胞侵襲能力的影響
Fig 3 Effect of epinephrine on the invasive ability of U251

β-AR阻滯劑抑制腎上腺素對(duì)U87MG和U251細(xì)胞遷徙和侵襲的促進(jìn)作用根據(jù)劑量-效應(yīng)曲線,使用10 μmol/L腎上腺素處理U87MG細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的遷徙能力較0 h顯著增加(P=0.003 2),且較對(duì)照組顯著增加(P=0.016 9);但使用10 μmol/L腎上腺素和10 μmol/L β-AR阻滯劑普萘洛爾共同處理U87MG細(xì)胞24 h后,U87MG細(xì)胞的遷徙能力和對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4A、C)。此外,使用10 μmol/L腎上腺素處理U251細(xì)胞24 h后,U251細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組顯著增加(P=0.017 4),但用10 μmol/L腎上腺素和10 μmol/L β-AR阻滯劑普萘洛爾共同處理U251細(xì)胞24 h后,U251細(xì)胞的侵襲能力和對(duì)照組相比,差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4B、D)?？梢?β-AR阻滯劑普萘洛爾能夠抑制腎上腺素對(duì)U87MG和U251細(xì)胞遷徙和侵襲的促進(jìn)作用。

腎上腺素增加MMP-9的表達(dá)和活性使用濃度為0.1、1、10、50 μmol/L的腎上腺素處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG后,細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá)隨腎上腺素濃度升高而增加,當(dāng)腎上腺素濃度增加到1 μmol/L時(shí),MMP-9 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P=0.018 9,圖5A);使用濃度為0.1、1、10、50 μmol/L的腎上腺素處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG,細(xì)胞上清液中MMP-9蛋白質(zhì)水平和MMP-9活性都隨著腎上腺素濃度升高而增加(圖5B、C)。

討 論

本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定等方法,探索了腎上腺素是否能促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。腫瘤細(xì)胞的增殖決定了腫瘤的生長(zhǎng),而其遷徙和侵襲能力決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移。MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定分別是評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力、遷徙和侵襲能力的常用方法。

有研究表明,手術(shù)相關(guān)應(yīng)激會(huì)降低患者對(duì)微小殘留灶疾病(minimal residual disease,MRD)的免疫抵抗,并直接促進(jìn)MRD生存和發(fā)展,兩者的綜合作用會(huì)增加癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),兒茶酚胺和前列腺素可直接作用于MRD[12]。盡管手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后,細(xì)胞介導(dǎo)免疫(cell-mediated immunity,CMI)能夠限制或消除MRD,許多患者仍表現(xiàn)為癌癥復(fù)發(fā),這可能與兒茶酚胺在體內(nèi)和體外多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗腫瘤CMI的作用相關(guān)[1,5,12]。兒茶酚胺還被證實(shí)可能促進(jìn)乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[3]。

A:Representative images of U87MG following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×40);B:Representative images of U251 following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×200);C:Distance to be migrated(mm)of U87MG;D:Number of invading U251 cells.E+P:Epinephrine plus propranolol.(1)vs.0 h within group(n=4),P<0.05;(2)vs.control group(n=4),P<0.05.

圖4 β-AR阻滯劑普萘洛爾抑制腎上腺素促進(jìn)U87MG細(xì)胞遷徙和U251細(xì)胞侵襲的作用
Fig 4 β-AR blocker propranolol can inhibit the effect of epinephrine on the migration of U87MG and the invasion of U251

腎上腺素作為主要的兒茶酚胺類激素,其胞外受體的激活被發(fā)現(xiàn)與癌癥進(jìn)展相關(guān)。AR分為α和β亞型。β-AR在促進(jìn)骨髓瘤和肺癌等多種癌細(xì)胞增殖[13-14],在前列腺腫瘤組織新生血管生成中起關(guān)鍵作用[5]。而β-AR非選擇性阻斷劑普萘洛爾能抑制兒茶酚胺介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)和血管生成[15]。也有研究表明β-AR能受體激動(dòng)劑并不能促進(jìn)U87MG細(xì)胞增殖[16]。本研究證實(shí)β-AR在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U87MG中均有表達(dá),且腎上腺素促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲,而普萘洛爾抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲。腎上腺素的這種作用是否通過β-AR途徑,是否與其他受體如γ-氨基丁酸B受體(gamma-aminobutyric acid B receptors,GABABR)、α2-AR等存在相互作用,仍需進(jìn)一步研究。

既往研究表明MMP-9和腫瘤進(jìn)展相關(guān):靶向IL-17A和MMP-9的雙特異性抑制劑可降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲和活動(dòng)能力[17];凝血酶(thrombin)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展相關(guān),而MAPK和PI3K信號(hào)通路激活對(duì)于凝血酶激活的作用是相反的,MMP-9具有調(diào)節(jié)以上兩種信號(hào)通路的作用[18]。MMP-9可能在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲中起到了非常重要的作用[18-19]。為了闡明MMP-9是否是腎上腺素促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG、U251增殖、遷徙和侵襲的相關(guān)蛋白,本研究檢測(cè)了MMP-9 mRNA和細(xì)胞上清液中MMP-9蛋白質(zhì)水平及其活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9隨著腎上腺素濃度升高表達(dá)增加且活性增強(qiáng)。今后將進(jìn)一步探索MMP-9在腎上腺素促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲中的機(jī)制。

A:Effect of various concentrations of epinephrine on the mRNA expression levels of MMP-9 in U87MG cells as measured by qRT-PCR.B:Effect of various concentrations of epinephrine on the protein expression levels of MMP-9 in U87MG cells.C:The cell-free supernatants were assayed for MMP-9 activity by gelatin zymography.(1)vs.control group(n=4),P<0.05.

圖5 腎上腺素對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG中MMP-9表達(dá)和活性的影響
Fig 5 Effect of epinephrine on the expression and activity of MMP-9 in glioblastoma U87MG cells

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素能促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲,而阻斷β-AR能夠拮抗腎上腺素的這種效應(yīng),且MMP-9隨著腎上腺素濃度升高其表達(dá)與活性均增強(qiáng)。腎上腺素促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的β-AR亞型及其下游信號(hào)通路將是我們下一步的研究目標(biāo)。