周楚靈 王曉慶 姜英華 劉 鋒

(復旦大學生物醫(yī)學研究院醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心 上海 200032)

胃癌是一種常見的惡性腫瘤,在男性和女性中的發(fā)病率排名分別為第4和第5,致死率排名分別為第3和第5[1]。2015年中國的胃癌死亡病例高達50萬[2]。

谷氨酰胺是人體中含量最豐富的氨基酸,可以為多種氨基酸、蛋白質、核苷酸及其他生物大分子的合成提供前體,包括谷胱甘肽(glutathione,GSH)[3]。當谷氨酰胺轉換為亮氨酸時能激活雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,對細胞生長造成顯著影響[4]。研究表明谷氨酰胺能影響多種腫瘤生長,如卵巢癌[5]、肝癌[6]和肺癌[7]。

氨基酸轉運載體2(amino-acid transporter 2,ASCT2)是一種定位于細胞膜上的Na+依賴的中性氨基酸轉運蛋白質,介導細胞對于中性氨基酸(包括谷氨酰胺)的攝取[8]。ASCT2對細胞內谷氨酰胺水平的維持有重要的作用,細胞內高水平谷氨酰胺對于維持mTOR信號通路的激活有關鍵作用。ASCT2被證明在多種癌癥中通過控制谷氨酰胺的轉運而調節(jié)細胞生長,如前列腺癌[9]、三陰性基底樣乳腺癌[10]和結腸直腸癌[11],是潛在的治療靶標。

本文通過體外實驗探究ASCT2在胃癌細胞中的表達及其在胃癌細胞增殖過程中的作用,以期為胃癌的診斷治療提供證據(jù)。

材料和方法

主要試驗儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(NUAIRE US AutoFlow和Thermo Scientfic Forma),細胞計數(shù)儀(Beckman),LAS-3000成像系統(tǒng)(FUJIFILM),掃描儀(GE Healthcare Image scanner Ⅲ),多功能酶標儀(BioTek),CKX41倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡DP70、光學顯微鏡(Olympus),BT25S/BS2202S電子精密天平(Sartorius),5810R型/5424型離心機(Eppendorf),IQ5定量PCR儀(Bio-Rad),PCR儀(杭州博日科技有限公司),電泳儀(PowerPacTMUniversal,Bio-Rad)。

材料和試劑MGC803和HEK293FT細胞系購自上海中國科學院細胞庫;SGC7901由上海交通大學于穎彥老師惠贈;AGS由上海芯片中心張慶華教授惠贈;PRMI1640培養(yǎng)基和DMEM/High glucose培養(yǎng)基(Gibco);細胞培養(yǎng)皿/板(Corning);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和青霉素鏈霉素溶液(Hyclone);Lipofectamine 2000轉染試劑、Trizol、Alexa Fluor-488標記的抗兔IgG和Alexa Fluor-594標記的抗鼠IgG(Invitrogen);限制性核酸內切酶和T4 DNA連接酶及PCR聚合酶(NEB);感受態(tài)細胞DH5α(北京天根生化);pENTER載體(山東維真生物),PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及質粒小抽試劑盒(QIAGEN);PVDF 膜(Millipore);DAPI和封片劑(碧云天);SYBR Premix Ex TaqTM(Roche);氯仿和結晶紫(Amresco)。

細胞培養(yǎng)MGC803、AGS和SGC7901細胞系使用PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),HEK293FT用DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用前均加入10% FBS和1%青霉素/鏈霉素,細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

穩(wěn)定細胞系的建立從Sigma官網(wǎng)(https://www.sigmaaldrich.com)下載shASCT2序列,由上海捷瑞生物有限公司合成,上游引物:5’-CCGGC-TGGATTATGAGGAATGGATACTCGAGTAT-CCATTCCTCATAATCCAGTTTTTG-3’,下游引物5’-AATTCAAAAACTGGATTATGAGGAA-TGGATACTCGAGTATCCATTCCTCATAATC-CAG-3’。構建含有shASCT2序列的質粒,用pLKO.1-shLuciferase與質粒分別轉化DH5α感受態(tài)細胞,擴增之后平板涂布,挑選測序正確的轉化子擴大培養(yǎng),利用質粒試劑盒抽提。利用HEK293FT細胞包裝含有pLKO.1-shLuciferase和shASCT2質粒的病毒,測試病毒滴度,把病毒加入到每孔含有3×105個細胞的6孔板中,同時每孔加入6 μg/mL聚凝胺,8 h后更換完全培養(yǎng)基,36 h后用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選48 h;更換成正常的完全培養(yǎng)基,直至有克隆株形成,用Western blot或RT-PCR鑒定穩(wěn)定細胞系建立情況。

構建及擴增瞬時過表達載體使用pENTER(維真生物)構建ASCT2過表達載體。轉化DH5α感受態(tài)細胞,涂板培養(yǎng)并進行菌落PCR,挑選陽性菌落測序驗證,測序正確后擴大培養(yǎng),利用質粒試劑盒抽提備用。

抗體p70S6K、Phospho-P70S6K、GSK3、Phospho-GSK3、mTOR、Phospho-mTOR(CST);GAPDH(CWBIO);β-actin(PTG);羊抗鼠(二抗)、羊抗兔(二抗)(Santa Cruz)。

細胞熒光免疫取生長狀態(tài)良好的細胞,用胰蛋白酶消化,進行細胞計數(shù)。在24孔板中放入細胞爬片,每孔接種1×105個細胞,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,用1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min;棄1×PBS,加入固定液(4%多聚甲醛,用1×PBS配制),室溫放置15 min;1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min,每孔加入0.5% Triton X-100(用1×PBS配制),室溫放置30 min;1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min,每孔加入500 mL 5% BSA(用1×PBS配制)溶液,室溫放置1 h;棄去封閉液,每一細胞爬片上滴加ASCT2和Ki67一抗,4 ℃孵育過夜;1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min,棄1×PBS后分別滴加熒光標記的二抗,室溫避光孵育1 h;1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min;每孔加入DAPI,室溫避光染核1 min;1×PBS浸洗玻片3次,每次3 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像,使用ImageJ合并圖像,使用Image-Pro 10軟件進行半定量計算熒光值。

RNA提取和qRT-PCR檢測使用Trizol法提取細胞內的總RNA,逆轉錄為cDNA。qRT-PCR 10 μL反應體系為:cDNA模板1 μL,SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL,上下游引物共1 μL(引物濃度為10 μmol/L),ddH2O 3 μL。PCR反應條件為:95 ℃、10 s;95 ℃、5 s,60 ℃、20 s,72 ℃、15 s,40個循環(huán);60～95 ℃、15 s。

MTT法檢測取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞,進行消化計數(shù),根據(jù)細胞大小調節(jié)細胞數(shù)目,按每孔1 000個細胞接種于96孔板中,周邊孔加入1×PBS,共5塊板,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24 h后取出1塊板,每孔加入20 μL MTT溶液(0.5 g/mL,0.45 μm濾膜過濾,錫箔紙避光保存),4 h后去除培養(yǎng)液,每孔加入200 μL DMSO,震蕩5 min,使細胞內的結晶充分溶解;酶標儀于490 nm波長下測定吸光度(D)值,繪制細胞生長曲線,重復步驟5次。

Western blot檢測將經(jīng)過定量的蛋白質與蛋白上樣緩沖液按比例混合,置于沸水浴中5 min,12 000×g離心5 min,將管壁上蒸發(fā)的水離心至管底,震蕩混勻后上樣。以恒壓90 V進行電泳,直到溴酚藍指示劑到達分離膠底部時停止。將PVDF膜用甲醇活化1 min,連同濾紙、電轉夾板浸泡在電轉液中;將電轉夾板取出,從正極到負極按照白板、海綿墊、2層濾紙、PVDF膜、分離膠、2層濾紙、海綿墊和黑板的順序將電轉夾板固定好,放入電轉槽中,恒壓100 V 2 h后,將PVDF膜用5%BCA封閉,室溫上搖床1 h,一抗孵育,4 ℃過夜,回收一抗,TBST洗膜,室溫下用二抗孵育1 h,棄二抗,TBST洗膜,用LAS-3000成像系統(tǒng)曝光。Western blot實驗重復3次,使用Image-Pro 10軟件計算灰度值。

平板克隆形成實驗取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞,消化后計數(shù),以每孔250個細胞數(shù)接種于6孔板中。細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng),3～4天更換一次抗生素,去除培養(yǎng)基,1×PBS洗滌3次,固定液固定細胞15 min,去除固定液,1×PBS清洗3次,用0.05%結晶紫溶液染色15 min,1×PBS洗滌后風干,拍照記錄,使用Image J軟件計算形成的細胞克隆數(shù)目。

統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計處理。對照組與實驗組間采用t檢驗,差異顯著性檢驗水平設為雙尾,P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

ASCT2在胃癌細胞系中的表達在人類胃癌細胞系和胃黏膜上皮細胞系GES1中檢測ASCT2的mRNA和蛋白質水平,結果顯示相比于GES1細胞系,ASCT2在所有胃癌細胞系中均有高轉錄水平以及蛋白質表達水平(圖1)。

ASCT2在胃癌細胞系中的RNA干擾與過表達使用ASCT2 shRNA慢病毒及過表達載體轉染胃癌細胞系AGS、MGC803和SGC7901。結果表明,相對于shRNA-NC轉染的細胞,ASCT2 shRNA質粒顯著抑制ASCT2在AGS、MGC803和SGC7901中的蛋白質水平;相對于pENTER-NC轉染的AGS、MGC803和SGC7901,pENTER-ASCT2質粒轉染后ASCT2蛋白質水平顯著上升。結果表明ASCT2 RNA干擾與過表達技術有效(圖2),圖中數(shù)字為ASCT2蛋白質表達的相對灰度值。

RT-PCR and Western blot were used to detect ASCT2 mRNA(A)and protein(B)expression.

圖1 在胃癌細胞系和胃上皮細胞系(GES1)中ASCT2的mRNA(A)和蛋白質(B)表達情況
Fig 1 ASCT2 mRNA(A)and protein(B)expression in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cell line(GES1)

Western blot was used to verify the over-expression(A)and silencing(B)ofASCT2 in gastric cancer cells.

圖2 在胃癌細胞系中過表達及穩(wěn)定沉默ASCT2
Fig 2 Over-expression and stable silencing ofASCT2 in gastric cancer cell lines

在AGS和SGC7901中ASCT2對Ki67表達的影響Ki67是細胞增殖所必需的核蛋白,與核糖體RNA的轉錄相關,滅活Ki67能導致核糖體RNA合成受到抑制,在G0期中不存在,在細胞周期的所有活動階段(G1,S,G2)都存在,特別是在細胞周期中最活躍的S期,細胞內的Ki67蛋白質大量增加[12]。相比于對照組(轉染pENTER-NC),實驗組(轉染pENTER-ASCT2)Ki67+細胞比例明顯增多(圖3)。

ASCT2對MGC803和SGC7901增殖和克隆形成的影響由于ASCT2能顯著影響胃癌細胞中Ki67蛋白質的表達水平,我們推測ASCT2也會影響胃癌細胞的增殖與克隆形成能力。用shRNA敲低ASCT2基因表達后,通過MTT實驗連續(xù)5天檢測轉染的MGC803與SGC7901的增殖情況。結果發(fā)現(xiàn)轉染ASCT2 shRNA MGC803和SGC7901的增殖比轉染shRNA NC的細胞顯著降低(圖4A)?？寺⌒纬山Y果表明,用ASCT2 shRNA轉染的MGC803和SGC7901胃癌細胞比來自shRNA-NC組的細胞形成的克隆數(shù)目更少(圖4C)。而相對于使用pENTER-NC質粒轉染的MGC803與SGC7901細胞,使用pENTER-ASCT2質粒轉染后的細胞無論增殖還是克隆形成都具有顯著的優(yōu)勢(圖4B和4D)。這些結果表明ASCT2能顯著影響胃癌細胞MGC803和SGC7901的增殖與克隆形成能力。

Using Ki67 staining in SGC7901(A)and AGS(B)after the up-regulation of ASCT2(pENTER-ASCT2)was detected by cellular immunofluorescence assay.

圖3 上調ASCT2增加Ki67+細胞的比例(×100,×400)
Fig 3 Up-regulation of ASCT2 raise Ki67+cell percentage(×100,×400)

A:Cell growth of SGC7901 was inhibited after ASCT2 silencing(P=0.008);while it was promoted after ASCT2 over-expression(P<0.001);B:Cell growth of MGC803 was inhibited after ASCT2 silencing(P<0.001),while it was promoted after ASCT2 over-expression(P=0.002);C:Cell clonal formation of SGC7901 was inhibited after ASCT2 silencing(P=0.001),while it was promoted after ASCT2 over-expression(P=0.003);D:Cell clonal formation of MGC803 was inhibited after ASCT2 silencing(P=0.067),while it was promoted after ASCT2 over-expression(P=0.014).

圖4 ASCT2對胃癌細胞MGC803和SGC7901增殖及克隆形成的影響
Fig 4 The effect of ASCT2 on cell proliferation and clonal formation of gastric cancer cell line MGC803 and SGC7901

ASCT2調控激活胃癌細胞的mTOR/p70S6K1通路在AGS、MGC803和SGC7901細胞中過表達ASCT2將激活細胞mTOR/p70S6K1信號通路,mTOR和PDK1的磷酸化顯著增高,進而促進下游基因p70S6K1與P21的表達;穩(wěn)定沉默ASCT2后,mTOR和PDK1的磷酸化顯著降低,下游基因p70S6K1和P21的蛋白質表達受到抑制(圖5)。

Western blot was used to detect the protein expression of mTOR signaling pathway and its downstream genes in AGS,SGC7901 and MGC803 after silencing(A)and over-expression(B)of ASCT2.

圖5 ASCT2激活胃癌細胞的mTOR信號通路
Fig 5 ASCT2 activates the mTOR signaling pathway in gastric cancer cells

討 論

幽門螺桿菌是胃癌最重要的環(huán)境風險因素,被世界衛(wèi)生組織認定為Ⅰ類致癌物,據(jù)統(tǒng)計全球約90%的非賁門胃癌新病例歸因于這種細菌[13]。研究表明胃癌的發(fā)生是因為多基因表達異常和多途徑導致[14]。胃癌的早期診斷率不足10%,細胞表面膜蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中舉足輕重。ASCT2作為氨基酸轉運受體定位于細胞膜上,對中性氨基酸(如L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸以及L-谷氨酰胺)的Na+依賴性攝取呈現(xiàn)出高親和力[15]。有研究表明ASCT2通過谷氨酰胺轉運從而對mTOR信號通路進行調節(jié)。在肝癌中,ASCT2的沉默能減弱谷氨酰胺的攝入,抑制mTORC1,從而影響細胞的生長[16]。ASCT2在多種癌癥中都高表達,并對癌細胞生長有重要影響,如肺癌[17]、前列腺癌和三陰性基底樣乳腺癌等。

本文利用shRNA和pENTER控制ASCT2在胃癌細胞系中的表達,利用RT-PCR、Western blot、細胞免疫熒光、克隆形成以及MTT試驗研究ASCT2對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響及其潛在調控分子機制。我們發(fā)現(xiàn)ASCT2能調控胃癌細胞的生長,當過表達ASCT2時胃癌細胞系的生長增殖、克隆形成能力都大大增強,反之當干擾ASCT2的表達時則表現(xiàn)出相反的結果。

mTOR是mTORC1和mTORC2復合物的主要組成分子,也是mTOR信號通路的關鍵分子,該信號通路對營養(yǎng)物質吸收、生長因子刺激和細胞能量代謝等進行整合,促進細胞代謝及細胞生長[18],還控制細胞周期進展[19]。此外,p70S6K1(mTOR的通路的下游分子)的磷酸化能促進細胞生長和細胞周期相關蛋白質的生物合成[20]。我們發(fā)現(xiàn)ASCT2過表達或沉默之后能顯著影響在AGS、MGC803和SGC7901細胞內mTOR/p70S6K1信號通路的磷酸化,Western blot檢測mTOR信號通路發(fā)現(xiàn),當過表達ASCT2時,在AGS、MGC803和SGC7901細胞內mTOR和PDK1的磷酸化水平大大增加,下游分子p70S6K1的磷酸化水平也相應增加,同時調控生長關鍵因子P21的表達上升。相比于對照組,使用shRNA穩(wěn)定干擾ASCT2的細胞系中,ASCT2的表達顯著下降,mTOR和PDK1的磷酸化水平減弱。

ASCT2過表達能激活mTOR信號通路,促進p70S6K1磷酸化,從而促進胃癌細胞的生長和增殖;反之,抑制ASCT2的表達能抑制mTOR信號通路,導致胃癌細胞的生長和增殖都受到抑制。結果表明,ASCT2能夠通過調控mTOR信號通路對胃癌細胞的生長和增殖產(chǎn)生影響。