■陳漪汶 郭奕軒 陳婉瀅 朱劍鋒 龐 旭 胡文鋒*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，廣東深圳 518118；3.廣州無(wú)兩生物科技有限公司，廣東廣州 510640)

預(yù)計(jì)2030年高收入國(guó)家的人均肉類(lèi)消費(fèi)量將增 加9%（與2000 年每人每年消費(fèi)86 kg 肉類(lèi)對(duì)比），而中國(guó)的人均肉類(lèi)消費(fèi)量則增加50%（與2000 年每人每年消費(fèi)49 kg肉類(lèi)對(duì)比），為此飼料糧的需求量會(huì)增加約48%（高收入國(guó)家）和158%（中國(guó)）[1]。谷物、高蛋白含量飼料的需求和肉類(lèi)的消費(fèi)密切相關(guān)，全球人均肉類(lèi)消費(fèi)量需求的增大，導(dǎo)致谷物糧食的需求量也隨之增加[2]。未來(lái)全球的糧食生產(chǎn)與肉食供應(yīng)將面臨巨大的壓力。另外，肉類(lèi)作為蛋白質(zhì)源除了供應(yīng)的問(wèn)題外，還存在著安全問(wèn)題[3-6]。

霉菌毒素是由曲霉菌屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬等霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[7-10]。霉菌毒素給人們帶來(lái)的危害十分巨大。例如，黃曲霉毒素是肝癌的誘因之一[11]；嘔吐毒素影響動(dòng)物的免疫應(yīng)答[12-13]與腸道功能[14]。針對(duì)霉菌毒素的問(wèn)題，我國(guó)、歐盟等國(guó)家或地區(qū)對(duì)食品與飼料中的霉菌毒素做出限量標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)因管理不善發(fā)生霉變，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受霉菌毒素的污染，約有2%的糧食由于霉變而不能食用，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到數(shù)百億美元[15]。

嘔吐毒素(Vomitoxin)，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，化學(xué)名為3α, 7α, 15-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，屬單端孢霉烯族化合物[16]，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[17]。嘔吐毒素有著較穩(wěn)定的物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)[18]，在加工、儲(chǔ)存過(guò)程中不會(huì)被破壞，對(duì)畜牧業(yè)有很大影響[19-20]。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嘔吐毒素在飼料中含量超過(guò)1 mg/kg時(shí)受試動(dòng)物普遍產(chǎn)生厭食行為且生長(zhǎng)受到影響[21]，降低動(dòng)物機(jī)體的免疫力和消化吸收能力[18]。嘔吐毒素乙?；蟮难苌镉?-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AC-DON）和15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-AC-DON），據(jù)Alizadeh 等[22]研究指出3-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AC-DON）、15-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-AC-DON）對(duì)細(xì)胞的不利影響較嘔吐毒素大。

昆蟲(chóng)作為全球種類(lèi)最多的生物類(lèi)群體，占據(jù)了地球一半以上的物種數(shù)目，是非?？捎^的可再生資源[23]。其體內(nèi)富含必需氨基酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和一些的微量元素，有成為食物或蛋白源的潛力[24]。黑水虻（Black Solider Fly）其體內(nèi)的粗蛋白質(zhì)含量與蠶豆、葵花籽等植物性蛋白飼料相近[25]，有作為飼料糧的潛力。黑水虻的幼蟲(chóng)以動(dòng)物糞便，腐爛的水果為食物，食量大，食性雜,目前被用在無(wú)害化處理糞便與餐廚垃圾的研究上[26]。經(jīng)研究表明黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)含有0.5 μg/mg黃曲霉毒素的飼料具有耐受性并且毒素不會(huì)積累在其體內(nèi)[27]。利用黑水虻處理受霉菌毒素污染的谷物，再把黑水虻作為牲畜的飼料，既可以有效利用廢棄谷物，又可以緩解未來(lái)蛋白質(zhì)飼料緊缺的問(wèn)題，一舉兩得。本文通過(guò)研究黑水虻對(duì)嘔吐毒素的耐受性與積累量，以探究黑水虻在處理受污染飼料的應(yīng)用價(jià)值和作為飼料的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

黑水虻（24 h 齡幼蟲(chóng)）由廣州無(wú)兩生物科技有限公司提供；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（100.7 μg/ml）、3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（100.3 μg/ml)）、15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（100.12 μg/ml）均購(gòu)自ROMER 國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；HLB 固相萃取柱（60 mg，美國(guó)Waters 公司）；固相萃取裝置（12 管，Su-pelco）；KL512型氮吹儀（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；乙腈、甲醇為色譜級(jí)（美國(guó)Ho-neywell 公司）；實(shí)驗(yàn)室用水均為Milli-Q 超純水儀制備得到；Poroshell 120 EC-C18 色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm，Agi-lent)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）。

1.2 方法

1.2.1 飼料準(zhǔn)備

用一定量乙腈稀釋100.7 μg/ml 的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)溶液，將上述溶液噴于飼料上，混勻，得到20 mg/kg 嘔吐毒素的有毒飼料。將適量的有毒飼料和無(wú)毒飼料混合得到20、10、5、2.5、1、0.1 mg/kg的有毒飼料，每組三個(gè)平行。

1.2.2 黑水虻飼養(yǎng)

取各濃度飼料4 g 與4 ml 的水混合，置于帶蓋培養(yǎng)盒中，將100只黑水虻幼蟲(chóng)（24 h內(nèi)破繭）置于培養(yǎng)盒中，用帶孔的蓋子蓋住以便換氣，將盒子置于培養(yǎng)箱中[（27±1）℃，（88±1）%相對(duì)濕度]培養(yǎng)15 d，期間改變盒子在培養(yǎng)箱中的位置，以消除位置的影響。15 d后，取出盒子稱重，將蟲(chóng)子、殘?jiān)珠_(kāi)稱重，將帶有殘?jiān)挠紫x(chóng)收集，用清水洗去殘?jiān)眉埥聿粮捎紫x(chóng)，再稱重。將黑水虻置于新的培養(yǎng)盒中，給予4 g 無(wú)毒飼料培養(yǎng)，2 d后按照上述的步驟收集并記錄黑水虻、殘?jiān)闹亓俊?/p>

1.3 樣品前處理、嘔吐毒素及衍生物含量分析

稱取1 g 樣品于10 ml 離心管中，加2 ml 水和1 g氯化鈉，渦旋均勻，靜置5 min，加入乙腈3 ml，超聲提取30 min，8 500 r/min離心5 min，取乙腈層于離心管中，加入乙腈飽和的正己烷混合液2 ml，渦旋混合，離心2 min，棄去正己烷層，再加入2 ml乙腈飽和的正己烷混合液2 ml 重復(fù)操作一次，將下層溶液于50 ℃氮吹至近干，加水溶解殘?jiān)齼艋?。將HLB 固相萃取柱連接到固相萃取裝置上，依次用3 ml甲醇和3 ml水活化，將待凈化液上柱，用5 ml 水淋洗，減壓抽干后，用5 ml甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，于50 ℃氮吹至近干，用30%乙腈水復(fù)溶，過(guò)膜，待上機(jī)。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；流動(dòng)相A：0.01%氨水，流動(dòng)相B：30%乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min：30%～95% B；5～6 min：95% B；6～6.1 min：95% B～30% B；6.1～10 min：30% B；流速：0.5 ml/min。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子（ESI-）掃描；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣、碰撞氣等在使用前調(diào)節(jié)各流量使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求；去簇電壓、碰撞電壓應(yīng)優(yōu)化最優(yōu)靈敏度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)處理采用Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行，差異顯著性分析和相關(guān)性分析采用SPSS24.0軟件進(jìn)行，顯著水平設(shè)為0.05，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜行為

根據(jù)嘔吐毒素及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI-電離模式。對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，確定3種毒素的母離子和子離子，以強(qiáng)度較大的子離子作為定量離子，強(qiáng)度稍小的子離子為定性離子，各化合物的定量離子及定性離子見(jiàn)表1。

表1 DON、3-AC-DON、15-AC-DON標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜行為

圖1 DON、3-AC-DON、15-AC-DON混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

如圖1 所示，DON、15-AC-DON、3-AC-DON 的混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，色譜峰沒(méi)有相連，相互影響小，分離效果佳，出峰時(shí)間分別為3.42、4.43、4.57 min。

2.3 飼料（加標(biāo)后）毒素濃度（見(jiàn)表2）

表2 各組別飼料加標(biāo)后DON的實(shí)際濃度

實(shí)測(cè)DON濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～5.2%,毒素混勻效果理想。在對(duì)照組中檢測(cè)出了0.03～0.04 mg/kg的DON，說(shuō)明飼料本身帶有一定量的DON。

2.4 嘔吐毒素對(duì)黑水虻生長(zhǎng)性能的影響(見(jiàn)圖2)

單因素方差分析結(jié)果表明：溶劑組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明乙腈對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)沒(méi)有影響；試驗(yàn)組中黑水虻幼蟲(chóng)的存活率達(dá)80%以上，平均體重達(dá)60 mg/條，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；因此DON 的濃度并不影響黑水虻幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)性能。

圖2 不同濃度DON對(duì)黑水虻生長(zhǎng)性能的影響

2.5 嘔吐毒素在黑水虻蟲(chóng)體及代謝殘?jiān)械睦鄯e（見(jiàn)圖3）

空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組中檢測(cè)到的DON濃度為30～40 μg/kg，飼料本身有一定量的嘔吐毒素。黑水虻蟲(chóng)體內(nèi)的DON 濃度為1～3 μg/kg，遠(yuǎn)低于飼料中的DON含量，飼養(yǎng)的飼料基本全被吃完，說(shuō)明了DON不在蟲(chóng)子體內(nèi)積累。隨著嘔吐毒素濃度的增高，殘?jiān)訕?biāo)）中DON 的濃度也隨之增高，說(shuō)明蟲(chóng)子會(huì)排出一定量的DON。2 d潔凈飼料飼養(yǎng)后的殘?jiān)ê暳希〥ON濃度與空白飼料濃度有顯著差異（P＜0.05），推測(cè)高濃度時(shí)蟲(chóng)子排出較多毒素，毒素濃度被提高。殘?jiān)訕?biāo)）中DON濃度與飼料中的DON濃度有顯著性差異（P＜0.05），殘?jiān)ú患訕?biāo)）中DON的含量與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05），推測(cè)黑水虻降解部分毒素。

2.6 嘔吐毒素衍生物（見(jiàn)表3）

蟲(chóng)體、飼料（加標(biāo)后）、殘?jiān)訕?biāo)）、殘?jiān)ú患訕?biāo)）中的3-AC-DON 和15-AC-DON 均低于檢測(cè)限，DON沒(méi)有被轉(zhuǎn)化成毒性更強(qiáng)的衍生物。

2.7 物料平衡

圖4體現(xiàn)了各試驗(yàn)組中蟲(chóng)體、代謝殘?jiān)蠨ON及其衍生物占加標(biāo)飼料毒素量的比率。試驗(yàn)中DON的損失率隨著DON濃度增大而升高，2.5、5、10、20 mg/kg試驗(yàn)組中DON 損失率達(dá)95%以上，說(shuō)明蟲(chóng)體消化了DON 且高DON 濃度時(shí)消化效率更高?？瞻捉M、溶劑組和0.1 mg/kg 組，其蟲(chóng)體和殘?jiān)訕?biāo)）中的DON 占的比例較大為6.7%～13.8%。1、2.5、5、10、20 mg/kg試驗(yàn)組中，殘?jiān)訕?biāo)）的DON占比例為1.2%～3%，其他部分占比均不足1%。

圖3 嘔吐毒素在黑水虻蟲(chóng)體及殘?jiān)械暮?/p>

表3 嘔吐毒素衍生物的檢測(cè)

圖4 加標(biāo)飼料的質(zhì)量守恒

3 討論

本研究評(píng)估了黑水虻對(duì)不同嘔吐毒素濃度的耐受性及積累量，進(jìn)一步探究黑水虻在處理受毒素污染的飼料上的應(yīng)用價(jià)值及其作為飼料、食物用蛋白質(zhì)源的安全性。嘔吐毒素不影響黑水虻的生長(zhǎng)性能（P＞0.05），嘔吐毒素在昆蟲(chóng)體內(nèi)的殘留量低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，黑水虻表現(xiàn)出極強(qiáng)的嘔吐毒素耐受性且可將其代謝分解排出體外。與動(dòng)物源食品相比，昆蟲(chóng)類(lèi)食品在保證必需微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入的同時(shí)，具有顯著的環(huán)境效益及安全性；與植物源食品相比，昆蟲(chóng)中必需營(yíng)養(yǎng)素的豐富性使它們成為當(dāng)前動(dòng)物源食品的優(yōu)質(zhì)替代品。昆蟲(chóng)在未來(lái)食品中具有可持續(xù)發(fā)展及健康飲食上的潛力。黑水虻對(duì)混合毒素、其他單一毒素的耐受性及積累量、嘔吐毒素在黑水虻體內(nèi)的代謝途徑有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文探究了DON對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)影響以及在黑水虻幼蟲(chóng)中的積累。試驗(yàn)證明：DON不影響黑水虻幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)性能（P＞0.05），DON在黑水虻幼蟲(chóng)中的積累量在1～3 mg/kg的水平中，屬于安全的水平，黑水虻幼蟲(chóng)可降解大部分的DON，DON 在黑水虻幼蟲(chóng)中不會(huì)轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的嘔吐毒素衍生物3-AC-DON或15-AC-DON，黑水虻幼蟲(chóng)可代謝DON。