■趙 磊 馮 鑫 陳 容 李麗霞*

（1.四川省食品藥品學(xué)校，四川峨眉 614201；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 天然藥物研究中心，四川成都 611130）

川牛膝為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuna）的干燥根。主產(chǎn)于四川雅安天全、金口河一帶，為川產(chǎn)道地藥材。具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的作用，經(jīng)常用于經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、足痿筋攣、尿血血淋等疾病[1]。但在產(chǎn)區(qū)，還廣泛分布有麻牛膝和雜交牛膝，因形態(tài)和親緣關(guān)系與川牛膝非常相近，故?；烊氪ㄅＯト胨?。

麻牛膝為莧科植物頭花杯莧(Cyathula capitata Moq)的根。雜交牛膝來源于C.officinalis×C.capitata，為川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)與頭花杯莧(Cyath-ula capitata Moq)的自然雜交種[2]。目前對于川牛膝研究報(bào)道較多，但對川牛膝及其混偽品的比較研究還較少，有學(xué)者對其從性狀鑒別和化學(xué)成分等方面對三種牛膝進(jìn)行鑒別。多糖為川牛膝的主要活性部分，具有抗腫瘤[3-4]、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老[5-6]、提高機(jī)體免疫力[7-8]和提高紅細(xì)胞免疫功能[9]等藥理活性。目前對于三種牛膝多糖組分和活性的比較研究還是空白，多糖含量和組分的差異，是反映三種牛膝品質(zhì)和臨床療效差異的重要指標(biāo)。

全球各國養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，飼料的安全備受關(guān)注的問題，特別是使用飼料添加劑存在的問題尤其明顯[10]?，F(xiàn)如今酶制劑、中草藥、寡糖、益生素、酸化劑等添加劑正在逐步取代抗生素作為新的飼料添加劑[11]。已有研究表明在飼料中加入中藥或其活性成分作為飼料添加劑，具有促進(jìn)動物生長[12-13]、改善動物生產(chǎn)性能[14-15]、提高免疫力[16]、增強(qiáng)繁殖機(jī)能[17-18]、防病抗病的功能[19]。

本文分別提取了3種牛膝的粗多糖，并采用陰離子交換柱和凝膠柱對其進(jìn)行分離、純化，比較了3中牛膝粗多糖含量、組分差異和分子量差異，測定了3種多糖對豬小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞活性和炎癥細(xì)胞因子IL-6基因的表達(dá)情況的影響。擬為川牛膝及其混偽品的品質(zhì)評價(jià)提供依據(jù)，為開發(fā)一種天然的飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

川牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）；麻牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為頭花杯莧(Cyathula capi-tata Moq)；雜交牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為雜交牛膝（C.officinalis×C.capitata）。

1.2 主要試劑

95%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、碳酸氫鈉溶液、1 mmol/l EDTA、0.1%疊氮化鈉溶液、DEAE-瓊脂糖凝膠FF（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）、瓊脂糖凝膠6FF（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500 和Dextran T-2 000（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）、氯化鈉、苯酚、硫酸，以上試劑均為分析純，CCK-8 試劑盒（CA1210，北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、離心機(jī)、中壓層析柱（50 mm×40 cm，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、凝膠層析柱（25 mm×100 cm，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、電腦自動部分收集器（BSZ-160F，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、酶標(biāo)儀（Varioskan flash，Thermo Fisher Scientific）、電子天平（JA2003B，上海越平科學(xué)儀器有限公司）、冷凍干燥機(jī)（LyoQuest-5，賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 粗多糖的提取

取藥材粉末200 g，用95%乙醇、50%乙醇除雜。殘?jiān)偌尤胝麴s水提取2 次，濾液濃縮至近干，冷凍干燥，得粗多糖。精密稱重，計(jì)算得率。

1.5 洗脫曲線的制備

利用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[20]。按多糖洗脫液200 μl，苯酚200 μl，硫酸1 ml的反應(yīng)體系，振搖使其充分反應(yīng)，冷卻至室溫后，移取100 μl至96孔板，再用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定其吸光度，以吸光度A值為縱坐標(biāo)，洗脫液體積為橫坐標(biāo)，制作洗脫曲線。

1.6 陰離子交換分離純化

精密稱取粗多糖0.5 g，用50 ml 蒸餾水溶解，用透析袋（分子量為3 500 Da）透析后，3 000 r/min離心后，取上清0.45 μm濾膜過濾。樣品上DEAE-瓊脂糖凝膠FF 柱，用蒸餾水洗脫，流速1 ml/min，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得中性多糖。再用0～1.5 mol/ml的氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，10 ml/管，苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，制作洗脫曲線后，收集不同洗脫峰的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得酸性多糖和中性多糖。精密稱重，計(jì)算得率。

1.7 凝膠柱層析分離純化

將分子量分別為10 000、40 000、70 000、500 000、2 000 000 的多糖標(biāo)準(zhǔn)品和蒸餾水溶解后的中性和酸性多糖樣品上瓊脂糖凝膠6FF 柱，蒸餾水洗脫，用苯酚-硫酸比色法[10]測定每一管標(biāo)準(zhǔn)品洗脫液的吸光值，取5 個標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以5 個含量曲線峰值對應(yīng)的體積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性關(guān)系分析，得到線性方程。取酸性及中性多糖樣品20 mg 溶于5 ml 蒸餾水中，上瓊脂糖凝膠6FF 柱，收集洗脫液，10 ml/管，苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，制作洗脫曲線。根據(jù)樣品的洗脫曲線不同洗脫峰峰值所對應(yīng)的體積，帶入線性方程，得到不同洗脫峰對應(yīng)的分子量。根據(jù)分子量的不同，合并樣品洗脫液，濃縮至近干，冷凍干燥，計(jì)算得率。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)

將IPEC-J2 細(xì)胞接種在含10% FBS（Gibco）的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待合適密度時，將細(xì)胞接種到6孔板中（每孔含1×106個細(xì)胞）；加入多糖處理12 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測。此外，還將細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔5×104個細(xì)胞），多糖（5 mmol/l和10 mmol/l）處理12 h后使用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活性。

1.9 細(xì)胞活性分析

細(xì)胞活性使用CCK-8 試劑盒，通過試劑盒說明書中的方法測定。即在培養(yǎng)板中加入CCK-8溶液（每孔中每100 μl加入10 μl），然后將培養(yǎng)板在37 ℃孵育1 h。使用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm處的吸光度值。

1.10 熒光定量PCR

將多糖處理完的細(xì)胞吸取培養(yǎng)基后，利用Trizol萃取法提取細(xì)胞總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermmentas）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以GAPDH（Fr 5’-TGGAAGGACTCATGACCACA-3’；5’-AGGGGTCTA-CATGGCAACTG-3’）為內(nèi)參，利用熒光定量PCR檢測IL-6（Fr 5’-GGAAATCGTGGAAATGAG-3’；Rv 5’-GCTTAGGCATAACGCACT-3’）的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 三種牛膝的粗多糖含量比較(見表1)

由表1可知，3種牛膝粗多糖含量差異很大，其中川牛膝的粗多糖含量最高，得率最高；其次是麻牛膝，最后是雜交牛膝，得率僅為0.38%。

表1 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝粗多糖含量比較

2.2 三種牛膝多糖組成的比較研究(見表2)

表2 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖組成比較

由表2 可知，3 種牛膝多糖構(gòu)成差異較大，其中川牛膝多糖主要為酸性多糖，麻牛膝和雜交牛膝中性多糖和酸性多糖所占比例基本相當(dāng)。3 種牛膝中中性多糖含量最高的是麻牛膝，最低的是川牛膝，麻牛膝中性多糖含量比川牛膝高約21 倍，酸性多糖含量最高的為川牛膝，最低的為雜交牛膝，川牛膝酸性多糖含量為雜交牛膝的8.4倍。

2.3 3種牛膝多糖分子量分布比較

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），以5 個含量曲線峰值對應(yīng)的體積為縱坐標(biāo)（y），得到線性方程為y=-102.18x+771.11，R2=0.994 7。

2.3.2 3種牛膝中性多糖的分子量分布比較

川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖分子量比較數(shù)據(jù)見表3。麻牛膝中性多糖純化圖譜見圖1，麻牛膝酸性多糖分離純化圖譜見圖2。

表3 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖分子量比較

圖1 麻牛膝中性多糖純化圖譜

由表3可知，川牛膝酸性多糖相對分子量分布比較廣，其中分子量在10 000 Da 以下的占酸性多糖的34.13%，10 000～30 000 Da 的占酸性多糖的4.44%，200 000～400 000 Da占酸性多糖的29.69%，1 200 000～1 700 000 Da的占粗多糖的31.74%。麻牛膝中性多糖分子量主要集中在7 500 Da左右，在中性多糖中占比達(dá)99.64%；酸性多糖分子量主要是分布在680 000 Da左右，占酸性多糖的80.99%。從雜交牛膝中純化得到一種中性多糖，其分子量主要集中在6 000 Da 左右；雜交牛膝酸性多糖分子量分布范圍較廣，且各分子量所占比例相差不大，分子量在6 500 Da左右的占酸性多糖的22.73%，分子量在157 000 Da 左右的占酸性多糖的27.27%，分子量在1 600 000 Da左右的占粗多糖的20.45%，分子量在2 100 000 Da左右的占酸性多糖的29.55%。

2.4 細(xì)胞活力檢測結(jié)果

因雜交牛膝多糖含量較少，無法進(jìn)行進(jìn)一步的活性實(shí)驗(yàn)，所以本試驗(yàn)未進(jìn)行后續(xù)的多糖活性試驗(yàn)。

0、5 μg/ml和10 μg/ml劑量川牛膝和麻牛膝多糖樣品作用后測定豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）的細(xì)胞活力，檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，高劑量和低劑量的川牛膝多糖及麻牛膝多糖均對細(xì)胞活力無明顯影響。

2.5 IL-6表達(dá)結(jié)果

10 mmol/l 藥物作用后進(jìn)行豬小腸上皮細(xì)胞IL-6基因表達(dá)檢測，IL-6表達(dá)結(jié)果見圖4。由圖4可知，川牛膝多糖和麻牛膝多糖都可使IL-6 的表達(dá)顯著降低，且川牛膝多糖效果優(yōu)于麻牛膝多糖。

圖2 麻牛膝酸性多糖分離純化圖譜

圖3 細(xì)胞活性檢測結(jié)果

圖4 炎癥細(xì)胞因子IL-6表達(dá)結(jié)果

3 討論

3.1 3種牛膝多糖的組分比較

川牛膝藥材品種混亂，目前市售川牛膝藥材中多夾雜麻牛膝和雜交牛膝。在有的地區(qū)，出現(xiàn)以麻牛膝和雜交牛膝代替川牛膝使用的現(xiàn)象[2]。目前對于川牛膝及其混淆品的研究主要集中在原植物鑒別、原藥材性狀鑒別和杯腺甾酮含量差異上[21-22]，未見關(guān)于川牛膝及其混淆品粗多糖含量及多糖組成差異比較的報(bào)道。本研究對此進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)3種牛膝粗多糖含量差異較大。其中川牛膝粗多糖含量最高，為7.40%，雜交牛膝粗多糖含量最低，為0.38%，川牛膝粗多糖含量為麻牛膝粗多糖的4.4 倍，雜交牛膝的19.5倍。且川牛膝的多糖以酸性多糖為主，占總多糖的94.40%，麻牛膝和雜交牛膝的中性多糖和酸性多糖所占比例差異不大。3 種牛膝多糖分子量差異較大，其中川牛膝多糖分子量主要集中在7 500 Da 左右，麻牛膝的中性多糖分子量主要集中在7 500 Da，酸性多糖分子量主要集中在680 000 Da 左右，雜交牛膝的中性多糖分子量主要集中在6 000 Da，酸性多糖分子量主要集中在2 100 000 Da左右。

多糖為川牛膝的主要活性成分，具有抗氧化[23]、抗衰老[24]、提高免疫力[25]、抗腫瘤[26]的作用。因此以多糖作為評價(jià)川牛膝品質(zhì)的重要指標(biāo)是很有意義的。本研究結(jié)果表明以多糖為指標(biāo)評價(jià)川牛膝及其混淆品的品質(zhì)，則川牛膝質(zhì)量最好，而麻牛膝和雜交牛膝由于多糖含量和組成差異很大，故不能替代川牛膝入藥。

3.2 3種牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞活性的影響

在與多糖相關(guān)的藥理活性中，3 種牛膝的療效差異尚未見報(bào)道，本研究在獲得川牛膝及其混淆品的粗多糖和純化多糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了三種牛膝多糖對細(xì)胞活性及炎癥細(xì)胞因子IL-6相關(guān)基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明川牛膝和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞活性無顯著影響，炎癥細(xì)胞因子IL-6 的相關(guān)表達(dá)試驗(yàn)表明川牛膝多糖和麻牛膝多糖都可使炎癥細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)顯著降低。證明川牛膝多糖和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞無毒性、能抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，且川牛膝多糖炎癥反應(yīng)抑制效果更好。

全世界的飼料總產(chǎn)量在逐年增加，2017年中國的飼料總產(chǎn)量位居世界第一，國內(nèi)抗生素類藥物被廣泛用作飼料添加劑，隨著抗生素殘留問題的日趨顯現(xiàn)，使研究者們意識到必須限制抗生素的濫用[27]。中藥作為代替抗生素的首選目標(biāo)，其優(yōu)勢在于，中藥來源于大自然中的藥用植物[28-30]、藥用菌物[31]、藥用礦物[32]等廣博資源，以無抗藥性、低殘留、不會對環(huán)境造成污染為優(yōu)勢和特點(diǎn)。本次試驗(yàn)已經(jīng)證明了川牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞的活性沒有影響，且能顯著降低炎性基因的表達(dá)，這表明川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝及其多糖具有成為一種新的飼料添加劑的潛力。

3.3 研究意義

本研究為解決川牛膝目前購銷和臨床應(yīng)用混亂的現(xiàn)象提供了科學(xué)依據(jù)，對川牛膝及其混淆品的品質(zhì)評價(jià)提供了思路和方法。川牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞活性無明顯影響，對炎癥反應(yīng)良好的抑制效果，為川牛膝及其多糖作為飼料添加劑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和方向。

4 結(jié)論

3種牛膝中，川牛膝多糖含量最高，且以酸性多糖為主，麻牛膝和雜交牛膝的中性多糖和酸性多糖所占比例差異不大，3 種牛膝多糖的分子量差異較大。以多糖為指標(biāo)評價(jià)川牛膝及其混淆品的品質(zhì)，則川牛膝質(zhì)量最好。

川牛膝多糖和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細(xì)胞無毒性、能抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，且川牛膝多糖炎癥反應(yīng)抑制效果更好。