陳洪燕，汪何畏，熊 軍，李亞玲*

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥學部，瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院信息部，瀘州 646000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨強度受損導致骨折危險性升高為特征的全身代謝性骨骼疾病，好發(fā)于絕經(jīng)后的婦女[1-2]。人體內(nèi)的骨重建是由成骨細胞和破骨細胞所調(diào)控的動態(tài)平衡過程，當破骨細胞介導的骨再吸收比成骨細胞介導的骨形成更多時將導致這種病理性骨疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，許多細胞因子、激素等均可直接或間接地調(diào)節(jié)骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和破骨細胞分化因子(kappa-B ligand，RANKL)及核因子-κB 受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)之間的關(guān)系，參與骨重建過程，因而OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)已成為防治骨質(zhì)疏松的新靶點[4]。金雀異黃酮(genistein，Gen)作為一種具有雌激素活性而沒有雌激素不良反應的替代物受到人們的重視[5]，本研究擬探討金雀異黃酮防治OP的機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 Delphi A雙能X線骨礦含量測定儀(美國Hologic公司)；AU-2700全自動生化分析儀(日本Olympus公司)；PIK-1200酶標儀(美國Thermo公司)；TS-200轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器廠)；165-8001垂直電泳槽,Gel Doc XR+凝膠掃描成像儀(美國Bio-Rad公司)；BP211D分析天平(德國Sartorius公司)；TGL-16G臺式冷凍離心機(北京醫(yī)療儀器廠)。

1.3實驗動物 3月齡健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量為200～250 g，動物合格證號為SCXK(川2013-17)，購于西南醫(yī)科大學實驗動物中心。

2 方法

2.2動物分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和金雀異黃酮酊組，每組10只。將各組大鼠以100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉，假手術(shù)組行假性手術(shù)摘除卵巢周圍1 g的脂肪組織，模型組和金雀異黃酮酊組均切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后采用標準飲食(不含豆類)恢復性飼養(yǎng)8周后，假手術(shù)組和模型組每日給予蒸餾水噴涂雙側(cè)股骨段皮膚，金雀異黃酮酊組給予金雀異黃酮酊10 mg·kg-1·d-1噴涂雙側(cè)股骨段皮膚，連續(xù)用藥8周。所有大鼠均在同等條件下喂養(yǎng)，自由攝水，控制食量。實驗結(jié)束后頸椎脫臼處死大鼠，腹主動脈取血，同時摘取各組大鼠子宮，觀察并稱定質(zhì)量。

2.3骨密度測定 干預治療8周后，采用Delphi A雙能X線骨礦含量測定儀測定雙側(cè)股骨干骺端骨密度值(bone mineral density，BMD)。

2.4血清鈣和磷測定 干預治療8周后，采用AU-2700全自動生化分析儀測定血清中鈣(Ca)和磷(P)的含量。

2.5Elisa法測定血清雌激素、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和Ⅰ型膠原交聯(lián)c-末端肽(S-CTX)含量 干預治療8周后，按照Elisa試劑盒使用說明書，依次將樣品血清稀釋、加樣，加酶標抗體，加顯色劑、終止液，用酶標儀測量吸光度值A，并按照標準曲線計算樣品濃度。

2.6Western Blot法測定血清OPG和RANKL蛋白表達水平 干預治療8周后，依次提取血清總蛋白，進行二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度測定，蛋白樣品上樣電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜，封閉，并分別用OPG和RANKL抗體進行一抗雜交，然后與HRP標記的二抗孵育，經(jīng)電化學(ECL)發(fā)光檢測、顯影定影后用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量和血清雌激素水平的變化情況 各組大鼠初始體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義，去卵巢造模8周后(干預前)，各組大鼠體質(zhì)量均增加，但差異均無統(tǒng)計學意義。在施加干預8周后(干預后)，各組大鼠體質(zhì)量均增加，但與模型組比較，假手術(shù)組和金雀異黃酮酊組體質(zhì)量增加均較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組和金雀異黃酮酊組大鼠子宮明顯萎縮、質(zhì)量明顯降低，模型組血清雌激素水平亦明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示卵巢去勢成功，結(jié)果見表1。

3.2各組大鼠股骨干骺端骨密度變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，金雀異黃酮酊組差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠骨密度明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨密度變化情況

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

Fig.1 Changes of femur BMD in each group

Note:*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX group.

表1 各組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量和血清雌激素水平變化情況

組別初始體質(zhì)量/g干預前體質(zhì)量/g干預后體質(zhì)量/g子宮質(zhì)量/g雌激素水平/ng·mL-1假手術(shù)組204.41±5.21245.25±6.23280.51±10.62#0.701±0.01582.23±10.31模型組207.64±7.53249.12±7.35313.23±13.510.351±0.016?52.78±8.77?金雀異黃酮酊組201.98±4.67243.42±7.54287.01±11.21#0.587±0.013?77.96±7.45

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

3.3各組大鼠骨代謝、骨轉(zhuǎn)換生物標志物變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的骨代謝標志物Ca和P的含量均明顯降低，而骨形成標志物(ALP和OC)、骨吸收標志物(S-CTX)含量均明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示絕經(jīng)后大鼠體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換率急劇增加，而金雀異黃酮酊組差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠骨代謝標志物Ca和P的含量均明顯增加、骨形成標志物(ALP和OC)和骨吸收標志物(S-CTX)含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠骨代謝、骨轉(zhuǎn)換生物標志物變化情況

組別Ca含量/mmol·L-1P含量/mmol·L-1ALP水平/U·L-1OC水平/ng·mL-1S-CTX含量/ng·mL-1假手術(shù)組2.31±0.14#2.02±0.11#121.12±12.43#11.81±3.01#19.33±4.45#模型組1.79±0.13?1.43±0.22?200.07±17.45?18.57±4.11?29.07±4.88?金雀異黃酮酊組2.25±0.16#1.87±0.21#135.36±15.89#13.27±2.67#23.01±3.53#

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

3.4各組大鼠OPG/RANKL/RANK信號通路變化情況 各組大鼠經(jīng)不同干預后，采用Western Blot法檢測血清OPG和RANKL蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠OPG蛋白表達水平明顯下降，RANKL蛋白表達水平明顯增加，導致OPG/RANKL比率明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，金雀異黃酮酊組差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠OPG蛋白表達水平明顯增加，RANKL蛋白表達水平明顯下降，導致OPG/RANKL比率明顯提高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠OPG/RANKL信號通路變化情況

A.各組大鼠OPG和RANKL蛋白表達情況；B.各組大鼠OPG蛋白相對表達量；C.各組大鼠RANKL蛋白相對表達量；與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

Fig.2 Changes of OPG/RANKL signal pathway in each group

A.the OPG and RANKL protein expression in each group; B.the relative expression of OPG protein in each group; C.the relative expression of RANKL protein in each group；*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX group.

4 討論

近年來，雌激素療法因其潛在的并發(fā)癥如乳腺癌、出血和心血管事件使其在防治OP中的應用受到限制，而防治OP的天然藥物，如金雀異黃酮酊、蛇床子素[6]和石斛堿[7]等取得很大的進展，因此，本研究通過制備金雀異黃酮酊，模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥體外模型，進一步研究金雀異黃酮酊對OP的防治效果。

去卵巢大鼠是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥使用最廣泛的動物模型。去卵巢大鼠的骨骼生理特征與中老年早期絕經(jīng)后的婦女相似，包括骨轉(zhuǎn)換的增加和松質(zhì)骨比正常骨的損失更大[8]。本研究通過切除大鼠雙側(cè)卵巢從而引起雌激素的減少，模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除的大鼠子宮明顯萎縮，質(zhì)量變輕，提示模型大鼠去勢成功；由于卵巢功能的衰退，雌激素的分泌量明顯減少，脂代謝異常，食欲亢進導致進食較多引起肥胖[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組造模16周后大鼠雌激素明顯降低，體質(zhì)量明顯增加，而通過外用金雀異黃酮酊干預后，可明顯抑制去卵巢大鼠的體質(zhì)量增加和雌激素的下降，可能與金雀異黃酮酊的類雌激素藥理作用能調(diào)動體內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)化、誘導脂肪組織凋亡有關(guān)[10]。

骨密度測量是明確骨質(zhì)疏松診斷及療效評價的主要手段[11]，研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠的骨密度明顯降低，表明切除卵巢誘導骨質(zhì)流失；而骨代謝與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)的生物標志物的變化進一步證明去卵巢大鼠與中老年早期絕經(jīng)后婦女骨變化生理機能相似。通過外用金雀異黃酮酊干預后，能明顯增加去卵巢大鼠的骨密度，改善絕經(jīng)后大鼠的骨質(zhì)流失，具有防治骨質(zhì)疏松的效果。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨轉(zhuǎn)換加速導致骨代謝生化標志物變化，這種變化不僅可以反映骨吸收與骨形成的平衡狀況，而且在骨質(zhì)疏松癥早期診斷、臨床療效評價和指導臨床用藥方面具有重要價值。血清中Ca和P是反映骨吸收最直接的指標，能夠發(fā)現(xiàn)明顯的骨吸收，但敏感度低，與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性存在爭議[12]。結(jié)果表明，外用金雀異黃酮酊能明顯增加血清中Ca和P的水平，可能與金雀異黃酮酊改善胃腸道Ca和P的吸收有關(guān)。

血清骨堿性磷酸酶(ALP)是成骨細胞分泌的一種糖蛋白，是骨形成的常用指標[13]，有促進骨基質(zhì)磷沉積、加強礦化作用，更年期骨質(zhì)疏松癥婦女ALP顯著升高[14]；本研究中，金雀異黃酮酊組ALP活性明顯低于模型組，說明金雀異黃酮酊對ALP活性具有一定的抑制作用。骨鈣素(OC)主要存在于骨和牙本質(zhì)中，主要由成骨細胞分泌并累積在骨骼的細胞外基質(zhì)中[15]。血清OC水平從30歲開始增加，特別是絕經(jīng)后顯著高于絕經(jīng)前，骨轉(zhuǎn)換率急劇增加[16]。研究表明，接受6個月以上雌激素治療的婦女血清OC的濃度可降低至絕經(jīng)前的水平[17]。本研究結(jié)果顯示，外用金雀異黃酮酊治療8周后，去卵巢大鼠血清OC濃度可恢復至假手術(shù)組水平。血清S-CTX由破骨細胞分解Ⅰ型膠原后形成，是目前國際公認的代表骨吸收的生化指標[18]，女性絕經(jīng)后S-CTX含量隨年齡增長而升高，尤其是絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型OP患者和骨折患者明顯高于絕經(jīng)前，本研究結(jié)果顯示，外用金雀異黃酮酊治療8周后，去卵巢大鼠血清S-CTX濃度明顯下降。通過上述分析發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮酊能通過降低骨形成和骨吸收生物標志物，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，從而治療絕經(jīng)后OP，減少骨折風險。

研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮酊可通過激活MAPK/NF-κB/AP-1誘導ERα基因表達，并因此刺激分化相關(guān)的基因表達和成骨細胞礦化[19]，隨著分子生物學在OP領域的深化，與TNF受體有關(guān)的蛋白質(zhì)RANKL和OPG成為介導骨質(zhì)疏松骨轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素。RANKL與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結(jié)合，促進破骨細胞的分化和激活，并抑制其凋亡；而OPG阻止RANKL與RANK的結(jié)合，起負調(diào)節(jié)作用，延緩前體破骨細胞的分化，降低骨吸收[20]。因此，RANKL和OPG比率的動態(tài)平衡在骨吸收中起重要的控制作用。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，金雀異黃酮酊組OPG水平較高，RANKL水平較低，導致OPG與RANKL比率提高，提示外用金雀異黃酮酊對去卵巢大鼠OPG水平有較強的促進作用，而對RANKL水平有較強的抑制作用，從而抑制破骨細胞的形成和骨重吸收，緩解絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的骨質(zhì)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。

綜上所述，外用金雀異黃酮酊可顯著調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝，提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，使骨質(zhì)疏松大鼠OPG蛋白表達提高，RANKL蛋白表達下降。但其具體作用機制仍需進一步從上下游信號通路進行研究，為未來臨床治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松提供新的選擇。