亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        PGE2及其受體在小鼠月經(jīng)模型中子宮內(nèi)膜崩解期的含量與表達(dá)研究

        2019-05-15 01:20:48周芳南楠陳西華賀斌尹德東盧文紅傅龍龍張博男郭士格梁敏王介東徐祥波
        生殖醫(yī)學(xué)雜志 2019年5期
        關(guān)鍵詞:孕酮孵育月經(jīng)

        周芳,南楠,2,陳西華,賀斌,尹德東,盧文紅,傅龍龍,2,張博男,2,郭士格,2,梁敏,2,王介東,徐祥波*

        (1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所,北京 100081;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院,北京 100730)

        經(jīng)典的月經(jīng)發(fā)生假說認(rèn)為,在分泌晚期,前列腺素(PGs)能促使子宮內(nèi)膜螺旋小動脈收縮,加速內(nèi)膜缺血、壞死及血管的破裂,進(jìn)而使子宮內(nèi)膜崩解脫落,導(dǎo)致月經(jīng)的發(fā)生[1-3]。Pickles[4]首次在經(jīng)血中檢測到了PGs的存在,最終認(rèn)為這些脂溶性物質(zhì)為前列腺素E2(PGE2)和前列腺素F2α(PGF2α)。然而,有研究者認(rèn)為它們是高等靈長類動物進(jìn)化的“廢棄物”,對月經(jīng)發(fā)生不具有始動作用[5]。小鼠月經(jīng)模型為月經(jīng)機(jī)制的研究提供了重要的技術(shù)平臺。本研究小組前期在小鼠月經(jīng)模型的研究中,孕酮撤退前,COX抑制劑吲哚美辛和COX-2抑制劑Dup697能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜的出血和崩解[6],而COX是PGs的限速合成酶,本研究小組前期研究為PGs在月經(jīng)發(fā)生中的主導(dǎo)作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)[7-9]。

        子宮中主要PGs之一PGE2的功能主要是和血管擴(kuò)張有關(guān)[10-11]。PGE2通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用,其受體屬于G偶聯(lián)蛋白受體,這些受體包括前列腺素E1受體(PTGER1)、前列腺素E2受體(PTGER2)、前列腺素E3受體(PTGER3)和前列腺素E4受體(PTGER4)[12]。其中,PTGER2主要在子宮組織的腔上皮下細(xì)胞表達(dá),有研究表明,在妊娠大鼠子宮組織中,PTGER2在著床位點(diǎn)的腔上皮細(xì)胞中的第1~4天沒有表達(dá),從第5天開始,其mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均升高,隨后從第7天開始表達(dá)下降[13]。在人的月經(jīng)周期中,早期分泌期的PTGER1是月經(jīng)期的12.2倍,中期分泌期的PTGER2是增殖期的15.1倍[12]。本研究利用小鼠月經(jīng)模型,探討了月經(jīng)發(fā)生子宮組織中PGE2含量及其受體PTGER2的表達(dá)變化,為揭示其在月經(jīng)發(fā)生中的功能提供線索。

        資料和方法

        一、研究對象

        實(shí)驗(yàn)動物:8~10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ級)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物,光照8:00~20:00,溫度(20±1)℃。

        二、研究方法

        1.建立小鼠月經(jīng)模型:根據(jù)前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型[14]。蛻膜化49 h后,移去孕酮皮下埋置管時記為0 h。分別在0 h、8 h、12 h、16 h和24 h取材,液氮中迅速冷凍后,于-80℃長期保存。

        2.PGE2蛋白質(zhì)含量的ELISA檢測:取不同時間點(diǎn)的小鼠子宮組織,稱重,加入PBS緩沖液,手持勻漿器(Cole-Parmer,美國)將小鼠子宮組織勻漿。離心,取上清,采用ELISA試劑盒(Cayman,美國)檢測勻漿組織中PGE2蛋白質(zhì)含量,分光光度讀數(shù)值(Thermal Fisher,美國)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出不同時間點(diǎn)子宮組織勻漿中PGE2的相對含量。

        3.Ptger2 mRNA的實(shí)時熒光定量PCR檢測:將-80℃保存的子宮組織標(biāo)本,用TRIzol(Invitrogen,美國)提取總RNA,42℃孵育3~5 min,消除基因組DNA。將總RNA與隨機(jī)引物及Oligo(dT)充分混合,25℃孵育10 min,42℃孵育50 min。85℃水浴孵育5 min后,冰上冷卻,將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。將各個時間點(diǎn)的小鼠子宮組織cDNA,用實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(Abm,加拿大)檢測Ptger2 mRNA表達(dá),以β-Actin作為內(nèi)參,利用ΔΔCt的方法統(tǒng)計(jì)分析mRNA的相對表達(dá)量。所用引物見表1。

        4.PTGER2蛋白免疫組織化學(xué)檢測:小鼠子宮組織用4%多聚甲醛固定24 h后,常規(guī)制備石蠟切片(Leica,德國)。將切片脫蠟并水化,用枸櫞酸緩沖液(pH6.0)95~98℃水浴孵育20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。再加入3%H2O2室溫孵育10 min,用PTGER2抗體對子宮切片進(jìn)行免疫組化染色,孵育兔抗鼠PTGER2多克隆抗體(Abcam,美國),按照二抗試劑盒(北京中杉金橋)方法孵育羊抗兔多克隆抗體,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,在顯微鏡下觀察,待顯色合適時終止。PBS中浸泡清洗后,用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,中性樹膠封片。

        表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

        5.PTGER2蛋白Western blot檢測:用蛋白提取試劑盒(Thermo Fisher,美國)提取小鼠子宮組織總蛋白,加入適量蛋白酶抑制劑Cocktail(Merck,美國);取20 μl蛋白溶液進(jìn)行SDC-PAGE凝膠電泳(Bio-Rad,美國),隨后轉(zhuǎn)移至0.25 μm PVDF膜(Merck,美國);分別進(jìn)行目標(biāo)蛋白PTGER2(Abcam,美國)和β-Actin(北京康為世紀(jì)生物)的蛋白免疫印跡,最后用ECL發(fā)光試劑盒(北京全式金生物)檢測其表達(dá)情況。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用Excel表對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩樣本之間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、小鼠月經(jīng)模型子宮組織中PGE2的含量

        PGE2在子宮內(nèi)膜崩解脫落期即孕酮撤退0~24 h子宮組織中的含量變化顯示,PGE2在整個過程呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(圖1)。在0 h和8 h PGE2含量較低,隨著時間的推移,在孕酮撤退12 h,逐漸增加(P<0.01),而在孕酮撤退16 h,PGE2含量達(dá)到最大值(P<0.01);在孕酮撤退24 h,略有下降,但仍顯著高于0 h(P<0.01)。在孕酮撤退12~24 h顯著高于0 h和8 h(P<0.01);孕酮撤退12~16 h是子宮內(nèi)膜崩解脫落的關(guān)鍵期,此時PGE2含量顯著增加,提示PGE2對子宮內(nèi)膜的崩解脫落起重要作用。

        相互比較,*P<0.01圖1 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0~24 h子宮組織PGE2蛋白表達(dá)

        二、PGE2受體PTGER2蛋白在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期的定位

        PTGER2蛋白在孕酮撤退的0~24 h定位于整個蛻膜化區(qū)域,且未呈現(xiàn)區(qū)域性的變化。在孕酮撤退的0 h,PTGER2的陽性信號較弱,主要定位于腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞區(qū)域和整個蛻膜化區(qū)域;在孕酮撤退的8 h,陽性信號定位與0 h相似;在孕酮撤退的16 h,陽性信號明顯增強(qiáng),主要定位于蛻膜化整個區(qū)域的細(xì)胞漿中,顏色呈深棕色,雖然信號強(qiáng)度增強(qiáng),但其定位并未呈現(xiàn)出區(qū)域性的特征;在孕酮撤退的24 h,陽性信號較16 h有所減弱,主要定位于中間蛻膜化剝脫壞死的區(qū)域(圖2)。

        三、Ptger2 mRNA與PTGER2蛋白在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期的表達(dá)

        在孕酮撤退后0 h,Ptger2 mRNA表達(dá)水平相對較低;隨后在孕酮撤退后8 h和16 h,雖然此時子宮內(nèi)膜崩解的程度進(jìn)一步加大,但是此時Ptger2 mRNA與0 h相比,無顯著變化(P>0.05);在孕酮撤退后24 h,Ptger2 mRNA的表達(dá)較孕酮撤退后0~16 h顯著升高(P<0.01)(圖3)。

        同時,對PGE2受體PTGER2在孕酮撤退0~24 h 的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)PTGER2蛋白質(zhì)在整個子宮內(nèi)膜崩解過程即孕酮撤退的0~24 h中的表達(dá)并沒有顯著變化(P>0.05)(圖4)。

        A和a:孕酮撤退后0 h;B和b:孕酮撤退后8 h;C和c:孕酮撤退后16 h;D和d:孕酮撤退后24 h左排為低倍視野(×100);右排為低倍視野中黑色方框區(qū)域的放大圖像(×400);箭頭示典型陽性著色圖2 小鼠月經(jīng)模型崩解期0~24 h的子宮組織PTGER2蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

        與其他各時間點(diǎn)比較,*P<0.01圖3 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0~24 h子宮組織Ptger2 mRNA表達(dá)

        圖4 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0~24 h子宮組織PTGER2蛋白表達(dá)

        討 論

        本研究探索了PGE2及其受體PTGER2在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期中的含量以及蛋白表達(dá)變化。本研究首先探討PGE2在子宮內(nèi)膜的崩解期即孕酮撤退的0~24 h各時間點(diǎn)的含量變化,發(fā)現(xiàn)在12~16 h時子宮內(nèi)膜的崩解期顯著增加,此時是子宮內(nèi)膜崩解關(guān)鍵期,提示PGE2對子宮內(nèi)膜的崩解可能起重要作用。PGE2的功能主要是和血管擴(kuò)張有關(guān)。有研究表明,月經(jīng)經(jīng)血中的PGE2水平是血清或腹膜液體中的2~3倍[15]。PGE2和PGF2α在月經(jīng)周期的分泌期增殖表達(dá)均升高,甚至貫穿表達(dá)于整個月經(jīng)周期[16-17],我們的研究結(jié)果與其一致。

        PTGER2作為一種刺激性G蛋白偶聯(lián)受體,PGE2誘導(dǎo)的PTGER2激活可激活腺苷酸環(huán)化酶,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)cAMP水平升高和蛋白激酶A的激活。PTGER2也可激活糖原合酶激酶3β和β-連環(huán)蛋白途徑[18]。PTGER2存在于牛的子宮內(nèi)膜中,其伴隨著內(nèi)膜中外植體生長因子的表達(dá)和細(xì)胞增殖表達(dá)而增加,預(yù)測其與子宮內(nèi)膜的生長密切相關(guān)[19]。有研究表明,在子宮內(nèi)膜異位癥婦女腹膜液中PGE2的含量較高,高濃度的PGE2對異位內(nèi)膜的生存和生長中起著重要作用[20]。PGE2能夠促進(jìn)含有PTGER2的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞系中HIF-1αmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。COX-2抑制劑可以明顯地減小子宮蛻膜區(qū)的大小,但PGE2可以恢復(fù)被COX抑制劑所抑制的子宮的蛻膜化過程。有研究者發(fā)現(xiàn)Ptger2-/-小鼠雖然可以正常著床,但著床的位點(diǎn)數(shù)量明顯減少。這可能由于Ptger2-/-小鼠中PGE2與其受體偶聯(lián),通過Gs激活腺苷酸環(huán)化酶,彌補(bǔ)了由于PTGER2缺失引起的cAMP不足。

        而本研究中,PTGER2在子宮內(nèi)膜崩解脫落期,mRNA的水平在除孕酮撤退的24 h之外,均無顯著性變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其蛋白水平在此過程中并無顯著性變化。同時免疫組化的結(jié)果顯示,PTGER2在子宮內(nèi)膜崩解剝脫的進(jìn)程中,在子宮中的分布并沒有顯著的區(qū)域性特征。PGE2的含量在崩解期特別是子宮內(nèi)膜崩解關(guān)鍵期顯著增加,然而其受體PTGER2無論在mRNA還是蛋白質(zhì)水平并無顯著變化,這提示PGE2對子宮內(nèi)膜崩解剝脫可能通過PGE2含量的增加來實(shí)現(xiàn),而不是通過其受體PTGER2表達(dá)的增加來實(shí)現(xiàn)。

        我們發(fā)現(xiàn)Ptger2 mRNA在孕酮撤退的24 h表達(dá)顯著升高,此時子宮內(nèi)膜完全脫落,新的腔上皮細(xì)胞已經(jīng)被覆完全,修復(fù)啟動,提示這可能與崩解后的脫落有緊密關(guān)系,而此時的蛋白質(zhì)并未出現(xiàn)此種情況,考慮mRNA翻譯到蛋白質(zhì)具有一定的時間差。在本研究中并未對其后的24 h PTGER2蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究,以探討PGE2及其受體PTGER2對修復(fù)期子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用。

        子宮內(nèi)膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。月經(jīng)從青春期后開始出現(xiàn),直到更年期結(jié)束,占據(jù)女性的一生中較長時間。月經(jīng)期的身體健康,對女性生活質(zhì)量影響重大。臨床上關(guān)于月經(jīng)疾病的痛經(jīng)、閉經(jīng)和功能失調(diào)性子宮出血的發(fā)生機(jī)制并不明確。了解正常月經(jīng)發(fā)生的作用機(jī)制,才能在臨床中找到治療靶點(diǎn)。

        猜你喜歡
        孕酮孵育月經(jīng)
        經(jīng)前煩躁障礙癥發(fā)病與四氫孕酮敏感性中西醫(yī)研究進(jìn)展
        月經(jīng)越來越少,是衰老了嗎
        來月經(jīng),沒有痛感正常嗎
        月經(jīng)量變少了,怎樣可以多起來
        來月經(jīng),沒有痛感正常嗎
        三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
        Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
        大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
        中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
        腹腔血與靜脈血β-HCG與孕酮比值在診斷異位妊娠中的價(jià)值
        孕酮調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性
        亚洲AV无码乱码精品国产草莓| 精品人妻伦九区久久aaa片| 97精品人妻一区二区三区香蕉| 亚洲日韩AV秘 无码一区二区 | 嫩草伊人久久精品少妇av| 久久99久久99精品中文字幕| 日本午夜精品理论片A级APP发布| av网站影片在线观看| 亚洲中出视频| 街拍丝袜美腿美女一区| 亚洲国产精品久久久久秋霞小说| 国产精品igao视频| 亚洲无码夜夜操| 亚洲综合精品一区二区 | 日本VA欧美VA精品发布| 玩弄放荡人妻一区二区三区| 手机在线看片国产人妻| 国产精品无码aⅴ嫩草| 在线观看国产高清免费不卡黄| 91国产自拍视频在线| 国产变态av一区二区三区调教| 大又大粗又爽又黄少妇毛片| 国产精品第1页在线观看| 久久精品中文字幕免费| 亚洲av综合国产av日韩| 无遮无挡爽爽免费毛片| 亚洲五月激情综合图片区| 国产一区精品二区三区四区| 未发育成型小奶头毛片av| 国产无遮挡又黄又爽又色| 亚洲欧美日韩精品香蕉| 中文字幕一区二区三区日日骚| 欧美日韩精品久久久免费观看| 欧美中文字幕在线| 人妻尤物娇呻雪白丰挺| 亚洲成av人片女在线观看| 无码成人aaaaa毛片| 亚洲欧美日韩国产综合专区| 高清中文字幕一区二区三区| 国产福利永久在线视频无毒不卡| 猫咪www免费人成网最新网站|