周 明，李 彪，歐陽(yáng)菠，鐘 赟，楊建東

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130）

綠尾虹雉（Lophophorus lhuysii），隸屬于雞形目（Galliformes）雉科（Phasianidae），為我國(guó)特有的大型高山雉類(lèi)，主要分布在四川西部海拔3 000～4 900 m的山區(qū)高山針葉林上緣及林線以上高山灌叢草甸，并邊緣性地分布于甘肅南部、青海東南部、西藏東部及云南西北部等地[1-2]。 由于綠尾虹雉分布區(qū)域狹窄和數(shù)量稀少，因此已被列為國(guó)家I 級(jí)重點(diǎn)保護(hù)瀕危野生鳥(niǎo)類(lèi)，IUCN 和CITES 分別將其列為易危物種（vulnerable，VU）和附錄I 物種，Chen Y.H.等[3]在對(duì)中國(guó)大陸特有鳥(niǎo)類(lèi)保護(hù)優(yōu)先度的研究中將綠尾虹雉列為最優(yōu)先保護(hù)的五種鳥(niǎo)類(lèi)之一。目前，關(guān)于綠尾虹雉的研究多集中在繁殖生態(tài)[4-5]、棲息地選擇[6]、時(shí)間分配[7-9]、叫聲聲譜分析[10-11]、種群密度[12]、血液生理生化指標(biāo)[13-14]及行為節(jié)律[7-8]等生態(tài)學(xué)和保護(hù)生物學(xué)方面。

Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）基因作為一個(gè)古老的先天免疫介導(dǎo)基因，最早于果蠅胚胎發(fā)育的研究中被發(fā)現(xiàn)，可將其分為病毒型TLRs 和非病毒型TLRs 兩大類(lèi)[15]。作為中間介導(dǎo)的模式識(shí)別分子，Toll 樣受體基因主要通過(guò)識(shí)別病原體進(jìn)化過(guò)程中的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），在先天免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程中起著橋梁作用[16，17]。 目前，已有的研究發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)類(lèi)中分布有10 個(gè)TLR 基因（TLR1A，TLR1B，TLR2A，TLR2B，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7，TLR15 和TLR21）[18-19]。TLRs 基因結(jié)構(gòu)屬于典型的Ⅰ型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，包括胞外的富亮氨酸重復(fù)序列區(qū)（leucine-rich repeats，LRRs）、 跨膜區(qū)和與白介素受體高度同源的胞內(nèi)區(qū)（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）[20-21]。

TLR5 基因作為T(mén)oll 樣受體家族基因中的重要成員，在動(dòng)物防御細(xì)菌病原體中起到重要的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR5 基因胞外區(qū)的LRR 區(qū)域能夠與革蘭氏陰性菌的鞭毛蛋白直接作用而激活TLR5 基因依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促發(fā)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)[23-24]。 TLR5 基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，能夠激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NFκB），進(jìn)而促使各種免疫相關(guān)基因的表達(dá)[25-26]。 由于TLR5 基因的缺失，導(dǎo)致小鼠缺乏對(duì)細(xì)菌鞭毛蛋白的識(shí)別，從而更容易患上肺部炎癥反應(yīng)和感染泌尿道大腸桿菌疾病[25]。鵝的TLR5 基因能夠識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白，并且誘導(dǎo)HEK293 細(xì)胞中NF-κB 因子表達(dá)的上調(diào)[27]。TLR5 R392*突變蛋白受體能夠嚴(yán)重?fù)p害TLR5 基因介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，因而促使受體更容易感染肺炎[28]。雖然早在2005年就成功克隆出了鳥(niǎo)類(lèi)的TLR5 基因，但與人TLR5 基因相比，禽類(lèi)TLR5基因?qū)κ髠抽T(mén)氏菌鞭毛蛋白具有更強(qiáng)的促炎反應(yīng)[29]。此外，缺乏鞭毛蛋白的鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)禽類(lèi)的感染能力顯著增強(qiáng)[30]。因此，大量的研究表明TLR5基因在哺乳動(dòng)物、 鵝和雞的先天免疫反應(yīng)中起到重要的作用，其功能狀態(tài)很可能與宿主對(duì)細(xì)菌感染的易感性至關(guān)重要。

然而，有關(guān)綠尾虹雉分子方面研究多見(jiàn)于利用線粒體基因探討其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[31-32]，而對(duì)分子免疫以及Toll 樣受體的研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因進(jìn)行克隆和進(jìn)化分析，以期了解該基因的結(jié)構(gòu)功能和適應(yīng)性進(jìn)化，為綠尾虹雉疾病防控相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 綠尾虹雉基因組總DNA 的提取

試驗(yàn)所用綠尾虹雉樣品保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。 總DNA 提取按照常規(guī)酚/氯仿抽提法提取[33]，提取的DNA 用ND-2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop，美國(guó)）檢測(cè)其濃度，最后DNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中錄入的原雞（登錄號(hào)：FJ915551.1）和鴻雁（登錄號(hào)：XM_013173959.1）TLR5 基因序列，利用primer5.0 在TLR5 基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，SF1（上游）：5′-AGATGATACCTCGTAGACT-3′，SR1（下游）：5′-AAAGCGAAATGATAAATA-3′；SF2（上游）：5′-GTTTTTCCACGAAGCCTAATA-3′，SR2（下游）：5′-AAAGCCAGCAACCCATCAA-3′；av-TLR1LAF and avTLR1LAR[34]，并送由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（成都）合成。

1.3 TLR5 基因的PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增模板為綠尾虹雉基因組DNA，PCR 反應(yīng)體系：1.5 μL（121 ng/μL）模板DNA、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，PCR 預(yù)混液（北京擎科）22.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，51-52.5 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳10 min（100V，80A），于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 PCR 產(chǎn)物克隆及序列測(cè)序

用Axygen 凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，將純化后的產(chǎn)物與pEASY-Blunt Zero 載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）于室溫連接15 min（V純化產(chǎn)物∶V載體=4∶1），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司），并于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)復(fù)蘇1 h； 然后將菌液在含有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上接種，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)（約12 h）；挑選單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃恒溫?fù)u床200 r/min，6～8 h，挑選6 個(gè)菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性的樣品送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（成都）進(jìn)行測(cè)序。

1.5 綠尾虹雉TLR5 的分子特征與同源性分析

采用Chromosoma1.62，SeqMan 等序列比對(duì)軟件對(duì)所測(cè)的TLR5 基因序列進(jìn)行人工校對(duì)、編輯。 利用NCBI 網(wǎng)站的ORF Finder 工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorffgorf.htm1）對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因開(kāi)放閱讀框進(jìn)行預(yù)測(cè)。 利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/） 在線分析軟件對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。 利用MEGA 6.0 軟件對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因的序列特征、堿基組成、氨基酸組成、突變位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 綠尾虹雉TLR5 基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

基于MEGA 6 和RaxML 7 軟件，采用鄰近法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建綠尾虹雉TLR5 基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。采用MEGA 6 軟件構(gòu)建NJ 樹(shù)，以Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter）為核苷酸替代模型，分支置信度采用自展（bootstrap）檢驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，自展檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1 000 次；ML 樹(shù)構(gòu)建，以Modelgenerator_v_851 預(yù)測(cè)最佳核苷酸模型，根據(jù)預(yù)測(cè)模型及參數(shù)采用RaxML 7 軟件構(gòu)建ML 樹(shù)，自展檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1 000 次。 其余9 種鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因登錄號(hào)為FJ915551.1（原雞，Gallus gallus）、JF767220.1（雉雞，Phasianus colchicus）、HQ436463.1（火雞，Meleagris gallopavo）、JF767221.1（珠雞，Guinea fowl）、XM_013173959.1（鴻雁，Anser cygnoides）、JN641303.1（灰雁，Anser anser）、XM_009275754.1（帝企鵝，Aptenodytes forsteri）、XM_009637106.1（小白鷺，Egretta garzetta）、XM_010074631.1（沙雞，Pterocles gutturalis）。

1.7 綠尾虹雉TLR5 適應(yīng)性進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0 軟件中的Pamilo-Bianchi-Li's方法對(duì)綠尾虹雉與其余9 種鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列的非同義替換數(shù)（non-synonymous substitutions，dN）和同義替換數(shù)（synonymous substitutions，dS）進(jìn)行計(jì)算，并基于單尾Z-檢驗(yàn)檢測(cè)dN/ dS（ω）偏離中性選擇的期望值。TLR5 基因的適應(yīng)性進(jìn)化利用PAML 4 軟件包中的Codeml 程序中的位點(diǎn)-特異模型（site-specific）進(jìn)行分析。 采用3 對(duì)統(tǒng)計(jì)模型M0（one ratio）vs M3（discrete）、M1a（nearly neutral）vs M2a（positive selection）和M7（beta）vs M8（beta+ω），根據(jù)兩兩成對(duì)模型最大似然值對(duì)數(shù)差的兩倍（2Δl）與自由度的χ2 分布進(jìn)行比較，使用保守貝葉斯經(jīng)驗(yàn)值（bayes empirical bayes，BEB）進(jìn)行后驗(yàn)概率檢測(cè)[35-36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠尾虹雉TLR5 基因的分子特征

通過(guò)PCR 克隆方法獲得綠尾虹雉TLR5 基因編碼區(qū)序列，GenBank 登錄號(hào)為MH908966。 如圖1所示，對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框分析表明其蛋白編碼區(qū)長(zhǎng)度為2 583 bp，共編碼860個(gè)氨基酸。 4 種堿基的平均組成比例分別為T(mén)（31.32%）、C（20.02%）、A（30.39%）和G（18.27%），A+T 含量為61.71%，高于C+G 含量為38.29%；綠尾虹雉TLR5 蛋白含有20 種常見(jiàn)氨基酸（圖1），以亮氨酸數(shù)量最多，占總數(shù)的15.47%（113/860），色氨酸數(shù)量最少，占總數(shù)的1.28%（11/860）。 功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明（圖2），綠尾虹雉TLR5 基因?yàn)榈湫偷蘑裥涂缒そY(jié)構(gòu)，主要由胞外集中的3 個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域和LRR_CT 結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)的TIR 結(jié)構(gòu)域組成。

2.2 綠尾虹雉TLR5 基因編碼區(qū)序列同源性分析

采用MEGA 6.0 對(duì)綠尾虹雉與原雞等9 種鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（表1），核苷酸比對(duì)結(jié)果顯示綠尾虹雉與雉雞、原雞、 火雞和珠雞的同源性較高，分別達(dá)到97.75%、95.54%、95.39%和94.18%，與鴻雁、灰雁、帝企鵝和沙雞的同源性次之，分別為86.71%、86.66%、86.70%和86.04%；與小白鷺的同源性最低（85.17%）。 氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示綠尾虹雉與雉雞、原雞、火雞和珠雞的同源性較高，分別達(dá)到96.86%、94.07%、93.83%和92.21%，與沙雞、小白鷺和帝企鵝的同源性次之，分別為83.95%、83.49%和83.37%；與鴻雁和灰雁的同源性最低（82.54%和82.31%）。

圖2 綠尾虹雉TLR5 基因蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果Figure 2 Protein domains prediction of TLR5 gene of Chinese monal

對(duì)TLR5 基因CDS 區(qū)核苷酸序列（2 583 bp）進(jìn)行比對(duì)，如表2所示，共檢測(cè)出680 個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，占總位點(diǎn)的26.33%。 其中，單核苷酸變異位點(diǎn)288 個(gè)，占總變異位點(diǎn)的42.35%，占總位點(diǎn)的11.15%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)392 個(gè)，占變異位點(diǎn)總數(shù)的57.65%，占總位點(diǎn)的15.18%。 對(duì)氨基酸序列（860 aa）進(jìn)行比對(duì)（表2），共檢測(cè)出276 個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)，占總氨基酸數(shù)的32.09%。 其中，單個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)90 個(gè)，占變異位點(diǎn)的32.61%，占總氨基酸位點(diǎn)的10.45%； 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)186 個(gè)，占變異位點(diǎn)的67.39%，占總氨基酸位點(diǎn)的21.60%。 進(jìn)一步對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因編碼蛋白的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)核苷酸和氨基酸的變異位點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)量占總核苷酸數(shù)量的比例分別為20.94%、0.93%、4.45%，氨基酸變異位點(diǎn)數(shù)總氨基酸殘基的比例分別位25.90%、1.16%、5.00%（表2）。

表1 不同物種間TLR5 基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比對(duì)Table 1 Homology comparison of TLR5 gene sequences between Chinese monal and 9 other birds %

表2 綠尾虹雉TLR5 基因編碼區(qū)不同區(qū)域DNA 序列（DNA）及其氨基酸序列（AA）的總長(zhǎng)度及變異位點(diǎn)數(shù)Table 2 Toal length and variable sites of different coding regions in Chinese monal TLR5 DNA and AA sequence

2.3 綠尾虹雉TLR5 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好的揭示綠尾虹雉TLR5 基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用鄰近法和最大似然法構(gòu)建NJ 樹(shù)和ML樹(shù)（圖3），兩種樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致，各節(jié)點(diǎn)支持率都在90%以上，為綠尾虹雉的系統(tǒng)發(fā)育提供了一種可能的參考。由圖2可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由3 個(gè)主要分支組成。綠尾虹雉首先與雉科的雉雞、火雞和原雞聚為一支，再與珠雞科的珠雞聚在一起形成一個(gè)雞形目亞組；來(lái)自鸛形目的小白鷺、企鵝目的帝企鵝和沙雞目的沙雞聚為一個(gè)亞組； 雁形目的鴻雁與灰雁單獨(dú)聚為一個(gè)亞組。 因此，綠尾虹雉與雉雞、火雞和原雞的親緣關(guān)系最近，與涉禽和游禽類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)的關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 TLR5 基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析

2.4.1 TLR5 基因編碼區(qū)進(jìn)化模式分析

圖3 綠尾虹雉與其他9 個(gè)鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化Figure 3 Phylogenetic tree of TLR5 gene sequences of Chinese monal and 9 others birds

圖4 綠尾虹雉TLR5 基因和其他鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因不同區(qū)域非同義替換（dN）和同義替換（dS）Figure 4 Non-synonymous substitution （dN） and synonymous substitution （dS） of different regions of the Chinese monal TLR5 gene and other birds.

TLR5 基因不同區(qū)域非同義替換（dN）、同義替換（dS）和dN/dS 相對(duì)頻率見(jiàn)圖4，綠尾虹雉TLR5 基因完整編碼區(qū)序列同其他9 種鳥(niǎo)類(lèi)的核苷酸替換結(jié)果均表現(xiàn)出dN＜dS，即（dN/dS）ω＜1。 顯著性檢驗(yàn)顯示，與雉雞達(dá)到顯著水平（P＜0.05），同其余8 種達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01）。進(jìn)一步對(duì)胞外編碼區(qū)、跨膜編碼區(qū)和胞內(nèi)編碼區(qū)分別分析時(shí)，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)區(qū)域均表現(xiàn)出（dN＜dS）ω＜1。對(duì)于跨膜區(qū)編碼區(qū)，雖然（dN＜dS）ω＜1，但是顯著性檢驗(yàn)結(jié)果均表現(xiàn)出不顯著，說(shuō)明在跨膜區(qū)編碼區(qū)處受到純進(jìn)化選擇的壓力相對(duì)較弱。 對(duì)于胞內(nèi)編碼區(qū)，綠尾虹雉同鴻雁、灰雁、小白鷺、原雞、帝企鵝、沙雞和珠雞的顯著性檢驗(yàn)為極顯著（P＜0.01），與雉雞達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而與火雞則表現(xiàn)出不顯著（P＞0.05），說(shuō)明胞內(nèi)編碼區(qū)受到了強(qiáng)烈的純凈化選擇（purification selection）。 對(duì)于胞外編碼區(qū)，綠尾虹雉與小白鷺、帝企鵝和沙雞的顯著性檢驗(yàn)為極顯著（P＜0.01），與鴻雁、火雞和珠雞達(dá)到顯著水平（P＜0.05），與灰雁、原雞和雉雞之間則不顯著（P＞0.05）。 因此，3 個(gè)區(qū)域卻展現(xiàn)出了不同的進(jìn)化選擇模式。

2.4.2 TLR5 基因編碼區(qū)選擇壓力分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以預(yù)示出TLR5 基因在各枝上的進(jìn)化速率可能不同（圖3），dN/dS 分析也表明TLR5 基因受到了強(qiáng)烈的純進(jìn)化選擇，但考慮到其高度分化的生態(tài)環(huán)境是否存在特異位點(diǎn)。 因此，我們選用PAML 軟件中的Codeml 程序的位點(diǎn)-特異模型檢測(cè)TLR5 基因編碼區(qū)所經(jīng)歷的選擇壓力。

通過(guò)對(duì)模型M0 和M3 的比較來(lái)檢驗(yàn)位點(diǎn)間的變異程度，如表3所示，它們的2 倍似然值[2Δ（lnL）=165.906 6]，極顯著大于df=4、P=0.01 時(shí)χ2分布的臨界值，說(shuō)明TLR5 基因在所檢測(cè)的位點(diǎn)間的進(jìn)化速率變異大，然而在模型M3 中未檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)。 M1a 和M2a，M7 和M8 兩對(duì)模型的比較用于檢測(cè)正選擇位點(diǎn)，模型M2a 估計(jì)正選擇位點(diǎn)的ω2=5.437 92，模型M8 的ω=1.766 93 均大于1，預(yù)示著TLR5 基因很可能存在正選擇位點(diǎn)。 在對(duì)模型M1a和M2a 進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，他們2Δ（lnL）=4.704 3，df=2、P＞0.05，說(shuō)明模型M2a 不顯著優(yōu)于模型M1a，因此不能拒絕模型M1a，同時(shí)在模型M2a 中也為檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)。在對(duì)模型M7 和M8 進(jìn)行比較時(shí)，他們2Δ（lnL）=9.524 0，df=2、P＜0.01，說(shuō)明模型M8 極顯著優(yōu)于模型M7，因此拒絕模型M7，選擇模型M8。 模型M8 估算出TLR5 基因在95%水平受到正選擇位點(diǎn)（ω＞1）的可能性有8.60%。模型M8 共檢測(cè)出3 個(gè)受到正選擇位點(diǎn)的氨基酸，對(duì)應(yīng)綠尾虹雉TLR5 編碼區(qū)氨基酸位置分別為263F、280K 和645I。

3 討論

TLRs 是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在觸發(fā)下游免疫級(jí)聯(lián)信號(hào)，啟動(dòng)對(duì)入侵病原體的免疫反應(yīng)中起到重要的作用[37]。TLR5 基因在哺乳動(dòng)物固有免疫中發(fā)揮著重要的作用[22-24]，近年來(lái)在雞和鵝TLR5基因的研究中表明，家禽TLR5 基因的同源蛋白在識(shí)別鞭毛蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)中有著相似的作用[27]。然而，在對(duì)于野生鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能的研究知之甚少。

表3 TLR5 基因在鳥(niǎo)類(lèi)中位點(diǎn)特異性模型檢驗(yàn)Table 3 The test of selective pressure on TLR5 gene in birds using site-specific models in PAML

TLRs 基因主要由胞外富含亮氨酸的LRR 區(qū)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR 區(qū)域組成[20-21]。 我們的研究也表明綠尾虹雉TLR5 基因也是類(lèi)似結(jié)構(gòu)，在胞外區(qū)的第90aa～190aa、300aa～400aa 和500aa～560aa 間存在3 個(gè)集中分布的LRR 區(qū)域和1 個(gè)LRR_TYP 結(jié)構(gòu)域。 然而，鴻雁和灰雁則分布有較多的LRR_TYP 結(jié)構(gòu)域[27]，在火雞胞外區(qū)卻沒(méi)有LRR_TYP 結(jié)構(gòu)域[29]。這表明TLR5 基因存在著物種特異性，而這種物種間的特異性適應(yīng)可能反映了特定宿主與相關(guān)微生物的協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系[38]。與低海拔的火雞、鴻雁和灰雁相比，綠尾虹雉主要分布在高海拔地區(qū)的大型陸禽，由于其生活環(huán)境的差異可能接觸了不同的病菌，使TLR5 分子在識(shí)別病原體的過(guò)程中發(fā)生了適應(yīng)性的進(jìn)化[34，39]。

同源性分析表明不同物種TLR5 基因核苷酸和氨基酸序列有著較高的保守性。 在進(jìn)一步對(duì)不同區(qū)域變異位點(diǎn)分布的研究發(fā)現(xiàn)，胞外區(qū)變異位點(diǎn)數(shù)占總變異位點(diǎn)數(shù)比例最大，核苷酸和氨基酸的變異比例分別為79.56%和80.10%，并且大多分布在LRR結(jié)構(gòu)域上。 Ruan W.等[40]在對(duì)10 種家雞TLR5 基因多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)所有氨基酸多態(tài)位點(diǎn)均分布在胞外區(qū)，其中有60%分布在LRR 結(jié)構(gòu)域上的結(jié)果相似。在家鴿的研究中也發(fā)現(xiàn)，家鴿TLR5 基因的多態(tài)位點(diǎn)大部分分布在胞外區(qū)[41]。已有的研究表明，胞外區(qū)的LRR 結(jié)構(gòu)域主要參與配體的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)，能夠識(shí)別特定的PAMP 分子，從而激活天然免疫反應(yīng)途徑[42]。 因此，我們可以推測(cè)綠尾虹雉TLR5 基因胞外區(qū)LRR 結(jié)構(gòu)域很可能也是潛在的與病原微生物相結(jié)合的區(qū)域。

進(jìn)一步對(duì)綠尾虹雉與另外9 種鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因蛋白編碼區(qū)位點(diǎn)的非同義替換（dN）和同義替換（dS）分析顯示，綠尾虹雉TLR5 基因與鴻雁和火雞等9中鳥(niǎo)類(lèi)之間存在這強(qiáng)烈的功能束縛，顯示出強(qiáng)烈的純進(jìn)化選擇。然而，在胞外和胞內(nèi)編碼區(qū)表現(xiàn)出極顯著的水平（ω＜1），而在跨膜區(qū)著表現(xiàn)出不顯著（ω＜1），這與在家雞和家鴿的研究結(jié)果相似[40-41]。 考慮到dN/dS在種群內(nèi)部變異位點(diǎn)識(shí)別的不敏感性[22，34，42]，我們利用PAML 軟件包中Codeml 程序的位點(diǎn)-特異模型檢測(cè)TLR5 基因編碼區(qū)各個(gè)位點(diǎn)所經(jīng)歷的選擇壓力。 選擇壓力分析中共檢測(cè)到3 個(gè)正選擇位點(diǎn)（263F，280K 和645I），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中263F和645I 兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在雉科鳥(niǎo)類(lèi)和鴨科鳥(niǎo)類(lèi)中，我們推測(cè)很可能是在識(shí)別病原微生物時(shí)發(fā)生了趨同的適應(yīng)性進(jìn)化[34，39]。 我們的研究發(fā)現(xiàn)280K 位點(diǎn)只出現(xiàn)在綠尾虹雉中，這可能與綠尾虹雉適應(yīng)高海拔環(huán)境下特異病原微生物有關(guān)[34，37]。這一結(jié)果揭示了鳥(niǎo)類(lèi)TLR5 基因在不同鳥(niǎo)類(lèi)中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，為今后開(kāi)展點(diǎn)突變的功能驗(yàn)證提供了理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究成功對(duì)綠尾虹雉TLR5 基因進(jìn)行了克隆和適應(yīng)性進(jìn)化進(jìn)行了分析。 各物種間TLR5 基因有著較高的同源性，通過(guò)功能結(jié)構(gòu)域的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，胞外區(qū)LRR 存在著種間特異性差異。 各物種dN/dS分析發(fā)現(xiàn)，TLR5 基因編碼區(qū)表現(xiàn)出較強(qiáng)的純凈化選擇，利用PAML 中位點(diǎn)-特異模型共檢測(cè)出TLR5 基因中有3 個(gè)氨基酸（263F，280K 和645I）位點(diǎn)受到正選擇作用，并且這3 個(gè)位點(diǎn)均分布在胞外編碼區(qū)。研究結(jié)果為進(jìn)一步理解和研究天然受體TLRs 在綠尾虹雉等野生鳥(niǎo)類(lèi)的天然免疫的分子機(jī)制、 適應(yīng)性進(jìn)化以及抗病育種提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，研究也填補(bǔ)了綠尾虹雉在Toll 樣受體基因研究方面的空白，為進(jìn)一步開(kāi)展綠尾虹雉相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控、 遺傳資源保護(hù)和分子適應(yīng)性進(jìn)化研究奠定了科學(xué)依據(jù)。