王統(tǒng)苗，常國斌，白 皓，江 勇，張 揚，王志秀，張 莘，劉本帥，陳國宏*

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009）

DNA 分子標記是一種經(jīng)典的遺傳標記，在分子遺傳學上廣泛應用，目前微衛(wèi)星是一種普遍使用的分子遺傳學標記，具有共顯性、多態(tài)性高、易于鑒定等優(yōu)點，在構建遺傳圖譜、QTL 定位、分子遺傳多樣性研究[1-2]等方面都有普遍應用。我國是世界上鴨品種遺傳資源最為豐富的國家，但是由于外來品種的大量引入和雜交，使許多地方品種資源急劇減少，我國地方鴨品種資源的保種情況不容樂觀。而遺傳多樣性的研究能為鴨品種資源的有效利用和優(yōu)良品種的培育提供依據(jù)?，F(xiàn)在已有多個微衛(wèi)星位點被用于鴨品種的遺傳多樣性研究。吳艷等[3]利用4 個微衛(wèi)星標記分析了6 個鴨品種（紹鴨、番鴨、櫻桃谷鴨、北京鴨Z4、北京鴨Z1 和奧白星鴨）之間的關系并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，為我國地方品種資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)；張燕等[4]利用3 個微衛(wèi)星標記分析了4 個番鴨品系的遺傳多樣性，以便為選育和配套系雜交利用提供基礎；張揚等[5]用12 對熒光標記的微衛(wèi)星引物對福建省5 個地方鴨品種進行遺傳多樣性分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)5 個地方鴨品種并不是按照地理距離進行聚類。

本研究首次在鴨品種遺傳多樣性分析中加入了2018年最新發(fā)現(xiàn)的遺傳資源：于田麻鴨（北方）和獨特觀賞價值兼肉用、藥用價值的潤州鳳頭白鴨[6]，同時選取中國肉鴨代表品種北京鴨、櫻桃谷鴨、藥用品種連城白鴨[7]，肉蛋兼用型品種吉安紅毛鴨[8]（南方）。為闡明于田麻鴨和潤州鳳頭白鴨遺傳多樣性狀況，采用改進毛細管電泳技術對這6 個鴨品種的16 個微衛(wèi)星座位進行檢測，對比分析6 個鴨品種的遺傳結構和相互關系，揭示于田麻鴨和潤州鳳頭白鴨的遺傳特征，為地方鴨品種資源開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

6 個地方祖代鴨品種分別是潤州鳳頭白鴨（鎮(zhèn)江天成農(nóng)業(yè)科技有限公司）、連城白鴨（福建省石獅國家級水禽基因庫）、櫻桃谷鴨（江蘇益客集團）、北京鴨（北京畜牧獸醫(yī)研究所）、吉安紅毛鴨（江西省吉安紅毛鴨資源保種場）、于田麻鴨（新疆于田縣），公母各15 只。

1.2 鴨基因組DNA 提取

于鴨翅靜脈處采血約2 mL，提取基因組總DNA 用傳統(tǒng)酚-氯仿法[9]，并且用ND-1000 蛋白核酸測定儀測定濃度和純度，稀釋到100 ng/L，于-20 ℃保存。

1.3 微衛(wèi)星位點

根據(jù)文獻[10-12]提供的16 對微衛(wèi)星座位AJ272580、AJ515884、CMO11、AY493256、CMO12、AJ515898、AY493249、AJ515893、SMO13、AJ515895、AJ272578、SMO4、AJ272579、AY493295、AJ272577、APL2 作為試驗位點。所選位點均表現(xiàn)為多態(tài)性良好，試驗所用引物均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。所用16 對微衛(wèi)星引物標記類型及退火溫度見表1。

1.4 PCR 反應體系與產(chǎn)物擴增

PCR 反應體系：Taq Master Mix(Dye Plus)10 μL，超純水7 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1 μL，100 ng/L DNA 模板1.0 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，53～63 ℃退火30 s（因座位而異），72 ℃延伸30 s，共32 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5 STR 分型測序

將熒光PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司，用ABI-3730XL 全自動測序儀做STR 分型測序。上樣總體積為11.5 μL，其中上樣液Hi-Di Formamide10 μL，GS-Size Standard（標準內(nèi)參）0.5 μL，混合PCR 產(chǎn)物1 μL。將Hi-Di Formamide 與GS-500 Size Standard 均勻混合后加入到等量混合好的PCR 產(chǎn)物中，加樣到96 孔板，變性然后上機進行毛細管電泳檢測。

1.6 統(tǒng)計分析

GeneMapper 4.0 軟件自動生成獨立的圖譜文件并讀出、峰值的大小、片段長度的大小、峰面積的大小，同時判斷純合子（單峰）或雜合子（雙峰）。利用Microsatellite-Toolkit 軟件計算等位基因頻率、期望與觀察雜合度，根據(jù)D.Botstein 等[13]的公式計算多態(tài)信息含量。

1.7 聚類方法

本文采用了UPGMA 聚類方法，以奈氏遺傳距離（DA）為依據(jù)，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

2.1 標記引物

選擇等位基因豐富并且符合要求的座位：AJ27 2580、AJ515884、AJ515893、AY493256、AY493249、AY493295、CMO12、SMO13、AJ272578、APL2、AJ515 898、AJ272579、SMO4、AJ272577、CMO11、AJ515895，共計16 個。根據(jù)文獻[9-11]中的基因大小，將16 個位點分為6 個組合（組內(nèi)引物擴增長度無重疊或相差大于50 bp），所選引物的其中一條（上游或者下游）的5'端，分別用熒光染料FAM，HEX 進行標記。最終獲得的16 個SSR 座位及其最優(yōu)化條件見表1。

表1 16 對熒光引物的最優(yōu)化反應條件Table 1 The optimize reaction conditions of 16 pairs fluorescence primers

2.2 熒光PCR 產(chǎn)物的STR 分型

基于ABI-3730XL 型DNA 測序平臺對擴增產(chǎn)物進行掃描。部分位點的擴增分型效果見圖1。

圖1 潤州鳳頭白鴨A04 個體在AJ272579 位點的PCR 擴增產(chǎn)物STR 分型結果Figure 1 STR genotyping result of AJ272579 locus of Crested White Duck individual A04

2.3 所選SSR 座位的遺傳多樣性

16 對熒光SSR 引物在個體層面上的遺傳學參數(shù)見表2，16 對引物在6 個群體中共檢測到141 個等位基因，平均每個位點8.8 個，有5 個位點的等位基因型均超過10 個，其中AY493295 位點檢測到的等位基因最多，為13 個。6 個鴨品種各個微衛(wèi)星基因座的有效等位基因數(shù)的變化范圍為1.112 1～3.892 0，其中基因座AY493256 的有效等位基因數(shù)最多，達3.892 0。而最少的是基因座SMO13，只有1.112 1個。16 個座位均為中高度多態(tài)位點，其中CMO11、AJ515898、AJ51893、SMO13、AJ27257、AJ272579、AJ272577 等7 個座位為中度多態(tài)位點，其他9 個座位為高度多態(tài)位點。

2.4 16 個微衛(wèi)星基因座在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）

從表3可以看出，基因座AY493256 的多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)及群體雜合度最高，基因座SMO13 最低，說明基因座AY493256 變異最大，基因座SMO13 變異最小。從不同群體來看，櫻桃谷鴨的多態(tài)信息含量最高，其次是于田麻鴨、北京鴨、吉安紅毛鴨、連城白鴨，而潤州鳳頭白鴨最低；吉安紅毛鴨的有效等位基因數(shù)最多，潤州鳳頭白鴨最少；于田麻鴨群體雜合度最大，潤州鳳頭白鴨最小。由表3可以得出潤州鳳頭白鴨的遺傳變異最小。

表2 16 對SSR 引物的遺傳學參數(shù)Table 2 Genetic parameters of 16 pairs of SSR primers

表3 16 個微衛(wèi)星基因座在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）Table 3 Polymorphism information content，the number of effective alleles and heterozygosisty of 16 microsatellite loci in each breeds

（續(xù)表3）

2.5 6 個鴨群體間的聚類分析

從圖2中可以看出，這6 個鴨品種總共分為兩大類，潤州鳳頭白鴨先與于田麻鴨聚為一類，再與連城白鴨聚為一類。潤州鳳頭白鴨和于田麻鴨都從野鴨進化而來，潤州鳳頭白鴨與連城白鴨都是白羽鴨，因此聚為一類；北京鴨先與櫻桃谷鴨聚為一類，再與吉安紅毛鴨聚為一類。北京鴨與櫻桃谷鴨都是北方鴨種，且都是肉用型鴨。

3 討論與結論

3.1 各品種的樣本量

圖2 基于Da 遺傳距離構建的6 個群體的UPGMA 聚類圖Figure 2 Phylogenetic tree of 6 duck breeds by UPGMA based on Da genetic distance

利用SSR 標記進行群體遺傳多樣性分析，對群體中個體樣本量有一定要求。本研究中6 個鴨品種的樣本量為30，對于品種的遺傳特性的分析，樣本量偏少。要想更深入的研究6 個品種之間的遺傳關系，還需擴大樣本量。

3.2 群體的遺傳多樣性

遺傳雜合度（H），又稱基因雜合度，是體現(xiàn)品種內(nèi)遺傳變異的一個重要指標[14]。本研究得出，6 個鴨品種在微衛(wèi)星座位的平均雜合度在0.385 4～0.518 7，在中等范圍，表明本研究群體的遺傳變異程度適中。D.Botstein 等[13]首先提出了用多態(tài)信息含量指標（PIC）來衡量遺傳變異程度；PIC 含量越大，在一個群體中該位點雜合子比例就越大，所提供的遺傳信息就越高。本研究結果表明，所選的16 個微衛(wèi)星標記中除CMO11、AJ515898、AJ51893、SMO13、AJ272578、AJ272579、AJ272577 等7 個座位為中度多態(tài)位點（0.25＜PIC＜0.50）其他9 個座位為高度多態(tài)位點（PIC＞0.50）?？勺鳛橛行У倪z傳標記用于鴨品種間遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)生關系的分析。

3.3 關于群體的聚類分析

遺傳距離是體現(xiàn)各品種間遺傳差異程度的重要指標。M.Nei[15]在1983年用有限等位基因模型（Infinite Allele Model，IAM）來進行計算機模擬時，發(fā)現(xiàn)Da 比其他遺傳距離更準確地得出系統(tǒng)發(fā)育進化樹。本研究基于Da 遺傳距離構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，潤州鳳頭白鴨、于田麻鴨、連城白鴨聚為一類。于田麻鴨是新疆地方品種，是由野鴨自然交配而形成，通過長期選育選配而成的具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的優(yōu)良地方品種，和潤州鳳頭白鴨聚為一類，因為這兩個鴨品種都是由野鴨進化而來。潤州鳳頭白鴨和連城白鴨都是南方鴨種，羽色都為白色，這可能使它們聚為一類。

北京鴨先與櫻桃谷鴨聚為一類，再與吉安紅毛鴨聚為一類。櫻桃谷鴨是北京鴨與英國當?shù)仄贩N雜交而培育出來的新品種，含有大部分北京鴨的血液，且是肉用型的品種[3]，所以它們聚為一類，與鄢緋寰等[16]、肖天放等[17]的研究結論相一致。北京鴨與吉安紅毛鴨聚為一類，這與張揚[12]的結果相一致。

本研究利用多態(tài)性較好的16 個微衛(wèi)星位點對中國地方6 個鴨品種進行了遺傳多樣性分析，所得的聚類圖能夠反映出6 個鴨品種間的親緣關系，6個鴨品種的多態(tài)信息含量高，遺傳多樣性豐富，我們在合理開發(fā)的同時更要做好保種工作，保存優(yōu)良的品種資源。