王淑燕，宋 雪，王 配，霍海龍，張 霞，張永云，李羅剛，王雪飛，霍金龍*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院/云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院教務(wù)處，昆明 650031；3.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實驗教學示范中心，昆明 650201）

豬到人異種器官移植是解決臨床移植供體來源不足的理想途徑，許多學者認為，小型豬體型小且性成熟早，在解剖、生理、代謝和疾病發(fā)生機理等方面與人極其相似，是理想的異種器官移植供體[1-3]。當前科學家主要通過敲除供體的免疫排斥抗原基因或?qū)胧荏w補體途徑上的關(guān)鍵抗原來改造供體動物，從而克服異種器官移植過程中的超急性排斥反應（hyperacute rejection，HAR）。血管異種移植物的排斥主要由抗體介導的過程所主導，包括補體介導的損傷和內(nèi)皮細胞的激活，導致異種移植排斥反應，表現(xiàn)為廣泛的微血管血栓形成和凝固性壞死[4]。該過程中除了α-1，3-半乳糖（α-Gal）作為關(guān)鍵的異種移植物排斥抗原[5]，還存在一種潛在的非Gal 免疫原Sda，它是一種血型抗原，跟大部分血型抗原一樣，都是存在于組織和體液中的碳水化合物結(jié)構(gòu)，有助于定義個體免疫表型[6]。該抗原起初在紅細胞表面被檢測到的，后來也發(fā)現(xiàn)在其他組織中廣泛分布[7]，因此被命名為“組織血型”抗原[8]。

B4GALNT2 是Sda 抗原合成關(guān)鍵催化酶，它屬于糖基轉(zhuǎn)移家族，被鑒定為GalNAc-轉(zhuǎn)移酶，也稱為β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2，其催化N-乙酰半乳糖胺的末端添加到唾液酸修飾的乳糖胺，以產(chǎn)生GalNAcβ4 [Neu5Acα2，3]Galβ4GlcNAcβ3Gal（Sda 血型抗原）[9]。有研究表明，B4GALNT2 基因在人胚腎293 細胞（HEK）中表達會導致抗體與B4GALNT2 酶的連接增加，當豬的心臟移植到靈長類動物體內(nèi)后，由于受到靈長類血清的刺激，HEKB4GALNT2 細胞會顯示出補體介導的裂解敏感性增加[10]。G.W.Byrne 等[11-12]使用豬到狒狒心臟異種移植后獲得的血清，研究鑒定了43 種潛在的非Gal靶抗原，包括從豬主動脈內(nèi)皮細胞（PAEC）表達文庫分離的6 種cDNA，當這些cDNA 在HEK 細胞上表達時，各自產(chǎn)生與狒狒非Gal IgG 結(jié)合的豬抗原。這些cDNA 經(jīng)BLAST 搜索，其中一個被鑒定為與Bos Tauru（牛）β1，4N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶（B4GALNT2）序列同源的豬糖基轉(zhuǎn)移酶[11]。Sda 抗原可作為不同細胞或微生物的特異性配體或受體[13]，與其生物合成酶β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（B4GALNT2）在各種生理和病理情況下發(fā)揮生物學作用。B4GALNT2 引起抑制素的非典型糖基化是導致Lacaune 母綿羊高排卵率的主要分子調(diào)控機制[14]；在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，Sda 抗原可以充當宿主和微生物群之間的中間體，敲除B4GALNT2 基因?qū)е履c道微生物群的變化[15]，Sda 還涉及預防肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)生[16-17]；M.D.Montiel 等研究發(fā)現(xiàn)B4GALNT2 基因可能是人結(jié)腸細胞分化的標志物[18]，增加Sda 在人胃腸癌細胞表面的表達可抑制癌細胞轉(zhuǎn)移[19]；Sda還可能介導豬原始胚胎細胞參與胚胎附著[20]。

版納微型豬近交系（BMI）不僅具有小型豬的特點，而且基因高度純合、遺傳背景清楚，在基因敲除、轉(zhuǎn)基因、異種器官移植等一系列基礎(chǔ)研究和臨床試驗等方面具有獨特的優(yōu)勢。本研究構(gòu)建目的基因（B4GALNT2）和報告基因（綠色熒光蛋白基因，EGFP）的重組真核表達載體pEGFP-C1-B4GALNT2，并將其轉(zhuǎn)染豬腎上皮細胞（PK15），來檢測細胞中綠色熒光表達，并用雙熒光染料分別對細胞核和線粒體進行染色，確定BMI B4GALNT2 在真核細胞內(nèi)的表達定位。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及主要試劑

RT-PCR 方法獲得的B4GALNT2 基因cDNA 序列（組織樣品來自耳號為413、417 和0847 的BMI），豬腎上皮PK15 細胞、EX Taq 酶、pMD18-T 載體、限制性內(nèi)切酶（Q.CUTEcoR Ⅰ和Q.CUTBamH Ⅰ）、pEGFP-C1 真核表達載體、Lipofectamine 2000、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、Mito Tracker 和Hoechst33342 染料。

1.2 設(shè)計真核表達引物

根據(jù)BMI B4GALNT2 基因的CDS 序列內(nèi)部限制性酶切位點及pEGFP-C1 綠色熒光蛋白真核表達載體多克隆位點的情況，設(shè)計引物F/R，在CDS上下游引物的5'端分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點（酶切位點序列用下劃線標識）。引物如下：

F：GAATTCATGACTTCGTACAGCCCTAG

R：GGATCCTTAGGTGACACATTGGAGAT

1.3 PCR 擴增及產(chǎn)物檢測

以BMI cDNA 為模板，用1.2 中設(shè)計的真核表達引物F/R 擴增B4GALNT2 真核表達序列。PCR 擴增體系25 μL：ddH2O 5.75 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物F/R（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板（50 ng/μL）1.5 μL，Ex Taq 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL。PCR 運行條件設(shè)置：預變性（94 ℃，5 min）；變性（94 ℃，30 s），退火（59 ℃，30 s），延伸（72 ℃，2 min），35 次循環(huán)；后延伸（72 ℃，10 min）。PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.4 BMI B4GALNT2 基因克隆

目的片段回收純化后與克隆載體pMD18-T 連接，16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、復蘇、培養(yǎng)使其形成單菌落。挑取陽性單菌落，37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)，16 h 后以0.2 μL 菌液為模板，進行菌液PCR 鑒定。將鑒定為陽性的菌液進行序列測定，選取測序結(jié)果無突變的菌液提取pMD18-T-B4GALNT2 重組質(zhì)粒。

1.5 B4GALNT2 基因真核重組表達載體構(gòu)建

用Q.CUTEcoRⅠ和Q.CUTBamHⅠ同時雙酶切pMD18-T-B4GALNT2 重組質(zhì)粒與pEGFP-C1 載體，雙酶切體系（50 μL）：重組質(zhì)粒/載體4 μL；10×buffer 5 μL；雙酶各1 μL；水39 μL?；厥漳康幕駼4GALNT2 片段及pEGFP-C1 的大片段并于16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a、復蘇、培養(yǎng)使其形成單菌落。進行菌液PCR 鑒定及測序，步驟同1.4。測序結(jié)果無突變的菌液提取pEGFP-C1-B4GALNT2 重組質(zhì)粒。

1.6 PK15 細胞培養(yǎng)及B4GALNT2 亞細胞定位

1.6.1 細胞復蘇

將凍存于液氮中的PK15 細胞取出37 ℃迅速解凍，與適量5%細胞培養(yǎng)液混勻后離心，棄上清，用15%細胞培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h 觀察記錄細胞生長情況，24 h 更換培養(yǎng)液。

1.6.2 傳代培養(yǎng)

細胞生長至對數(shù)增長期（即匯合率達80%～90%）時進行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗，加入胰酶消化1～3 min，待細胞呈圓形、游離狀態(tài)時，終止消化，離心，棄上清，加入10%細胞培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，完成一次細胞傳代。

1.6.3 轉(zhuǎn)染、染色及成像

轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種至六孔板中，待細胞達到30%～40%匯合率時進行轉(zhuǎn)染。將BMI pEGFPC1-B4GALNT2 真核表達重組質(zhì)粒以及pEGFP-C1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PK15 細胞，同時以未轉(zhuǎn)染的PK15空細胞作為空白對照，以轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1 空載體的PK15 細胞作為陰性對照。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合均勻后，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，進行轉(zhuǎn)染，每孔細胞中加入500 μL 轉(zhuǎn)染液和1 mL DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后更換為10%FBS 的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18～48 h 后檢測綠色熒光，以確定轉(zhuǎn)染成功及正常表達。先后用Mito Tracker 和Hoechst33342分別對細胞進行染色，倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 B4GALNT2 真核表達序列擴增結(jié)果

引物F/R 擴增B4GALNT2 真核表達序列電泳結(jié)果見圖1，片段大小為1 521 bp，包括完全編碼區(qū)1 509 bp 和兩端添加的EcoRⅠ和BamHⅠ各6 bp的酶切位點。

圖1 BMI B4GALNT2 真核表達PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 The agarose gel electrophoresis result of eukaryocyte expression PCR products of BMI B4GALNT2

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙限制性內(nèi)切酶對提取的pMD18-T-B4GALNT2 和pEGFP-C1-B4GALNT2質(zhì)粒進行鑒定，電泳條帶分別為2 698/1 521 bp 和4 700/1 521 bp，結(jié)果符合預期，表明克隆質(zhì)粒pMD18-T-B4GALNT2 和真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1-B4GALNT2 構(gòu)建成功，如圖2所示。

圖2 pMD18-T-B4GALNT2（A）和pEGFP-C1-B4GALNT2（B）重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Figure 2 Identification of the pMD18T-B4GALNT2（A）and pEGFP-C1-B4GALNT2（B）recombinant plasmids

2.3 pEGFP-C1-B4GALNT2 在PK15 細胞中的表達與定位

將轉(zhuǎn)染后的PK15 細胞培養(yǎng)24～48 h 用蔡司倒置熒光顯微鏡進行觀察，結(jié)果能夠檢測到明顯的綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功。對線粒體和細胞核進行染色后繼續(xù)觀察，藍色熒光部分代表細胞核，紅色熒光部分代表細胞質(zhì)。綠色熒光的位置與紅色熒光重疊，由此確定目的蛋白B4GALNT2 主要在細胞質(zhì)中表達（圖3）。通過PSORTⅡserver（http：//psort.hgc.jp/）對B4GALNT2 蛋白進行亞細胞定位預測，預測結(jié)果44.4%定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，22.2%定位在線粒體，22.2%定位在高爾基體，另有11.1%定位在細胞質(zhì)。已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體都是位于細胞質(zhì)基質(zhì)中的細胞器，因此網(wǎng)站預測結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

圖3 pEGFP-C1-B4GALNT2 重組質(zhì)粒在PK15 細胞中亞細胞定位Figure 3 Subcellular localization of pEGFP-C1-B4GALNT2 recombinant plasmids in PK15 cell

3 討論與結(jié)論

在靈長類動物中預先形成的對人血清產(chǎn)生細胞毒性的非Gal 抗體會引發(fā)早期異種心臟移植損傷，并足以在低濃度下誘導超急性排斥反應[21]。J.L.Estrada 等[22]同時敲除α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1）、胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）和β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（B4GALNT2）的基因，克隆出具有3 種抗原缺陷基因的GGTA1/CMAH/B4GALNT2-KO 豬，與只有兩種抗原GGTA1/CMAH 缺陷基因的豬相比，發(fā)現(xiàn)從3 種基因都缺失的豬中分離出的外周血單核細胞（PBMC）與人IgM/IgG 的結(jié)合明顯減少，且在人和狒狒血清中顯示出了低水平的抗體反應性。J.R.Butler 等[23]通過沉默豬B4GALNT2 基因，發(fā)現(xiàn)與人血清中IgG 和IgM 抗體結(jié)合分別減少49.1%和43.2%，而同時沉默豬中的GGTA1、CMAH 和B4GALNT2 基因可顯著降低豬對人的抗性。因此改變豬的碳水化合物結(jié)構(gòu)可以有效地減少人抗體介導的補體依賴性細胞毒性以及抗體介導的排斥反應，將有助于異種器官移植臨床的實現(xiàn)。

B4GALNT2 蛋白具有質(zhì)膜和細胞質(zhì)兩種不同的細胞定位，細胞質(zhì)包括高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器和其他結(jié)構(gòu)。如果一個糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的翻譯后修飾中發(fā)揮作用，那么它應該位于高爾基體上[24]。將小鼠B4GALNT2-GFP 嵌合體轉(zhuǎn)染囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞，顯示目的蛋白定位在質(zhì)膜上；在懷孕小鼠的子宮組織中，B4GALNT2 蛋白則定位于細胞質(zhì)而不是質(zhì)膜上[24]?？笲4GALNT2 和凝集素抑制試驗證實B4GALNT2 和Sda 抗原通過小鼠系統(tǒng)和人子宮內(nèi)膜細胞系在體外和體內(nèi)參與胚胎附著[25]，結(jié)合之前關(guān)于雌性小鼠生殖系統(tǒng)中B4GALNT2 基因調(diào)控的研究[26]進一步表明B4GALNT2 和Sda 抗原是胚胎植入所必需的，B4GALNT2 是一種參與胚胎植入的質(zhì)膜蛋白。

在本研究中，我們采用RT-PCR 擴增了帶有酶切位點的編碼區(qū)，構(gòu)建了BMI B4GALNT2 與綠色熒光蛋白的融合表達載體。BMI B4GALNT2 的亞細胞定位通過在PK15 細胞中瞬時表達的綠色熒光蛋白融合表達載體pEGFP-C1-B4GALNT2 來確定。通過非病毒感染的脂質(zhì)體介導法，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pEGFP-C1-B4GALNT2 成功轉(zhuǎn)染PK15 細胞，以綠色熒光蛋白（EGFP）作為標簽蛋白來示蹤B4GALNT2 在PK15 細胞中的表達和定位情況。結(jié)合亞細胞定位的試驗結(jié)果和PSORTⅡserver 網(wǎng)站的預測表明，B4GALNT2 蛋白主要定位于細胞質(zhì)，揭示該蛋白在細胞質(zhì)中發(fā)揮其功能作用。綠色熒光蛋白真核表達載體的成功構(gòu)建，將為進一步探索BMI B4GALNT2 基因在細胞內(nèi)的作用機制奠定基礎(chǔ)。

B4GALNT2 基因有一個十分罕見的特征，它不僅能產(chǎn)生兩個具有不同轉(zhuǎn)錄位點的轉(zhuǎn)錄本，而且還能產(chǎn)生兩個具有不同N-末端的蛋白異構(gòu)體[18]。長轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)由66 個氨基酸殘基組成異常長的胞質(zhì)尾，而短轉(zhuǎn)錄本翻譯的蛋白質(zhì)具有與小鼠序列同源的非常短（6 個氨基酸殘基）的胞質(zhì)尾[27]。長和短的蛋白異構(gòu)體都具有酶促活性[28]，并且能夠在轉(zhuǎn)染的細胞中合成Sda 抗原。其中長蛋白異構(gòu)屬于最長的糖基轉(zhuǎn)移酶之一，參與細胞內(nèi)定位等特定的功能。Sda 抗原序列合成的研究表明，β1，4-GalNA的加入是發(fā)生在加入α2，3-唾液酸之后[29]，所以B4GALNT2 必須（或至少部分）定位在不含α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的高爾基體中[6]。位于高爾基體中的真核生物糖基轉(zhuǎn)移酶通常由一個短N 末端胞質(zhì)尾部，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，一個可變長度的莖區(qū)和一個大的C 末端球狀催化結(jié)構(gòu)域組成[30]。預測的B4GALNT2蛋白的一級序列具有與其他糖基轉(zhuǎn)移酶相似的II型跨膜蛋白的特征。

人們普遍認為B4GALNT2 是唯一能夠合成Sda抗原的酶，并且該酶是單一遺傳基因座的產(chǎn)物。因此，B4GALNT2 實現(xiàn)組織特異性酶表達的最有可能的機制，是交替使用不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的兩個不同B4GALNT2 基因啟動子[5]。未來的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究將有助于闡明由兩個密集的啟動子產(chǎn)生的每個轉(zhuǎn)錄本的生物學意義，這為我們后續(xù)更加深入地探索B4GALNT2 基因的功能提供了研究方向。