李 輝 李雷林 高 媛 楊宇純 劉 歡 薛艷紅 劉士平

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

魔芋的有效成分是具有降血壓、降血脂、降血糖、改善腸道功能和減肥等功效的一種膳食纖維——魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan, KGM)，同時(shí)還能增加飽腹感，是一種廣受歡迎的健康食品[1]．然而，在魔芋產(chǎn)業(yè)進(jìn)行大規(guī)模推廣開(kāi)發(fā)的時(shí)候，有一個(gè)關(guān)鍵的制約因素即魔芋軟腐病，是魔芋生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害，俗稱(chēng)“半邊瘋”[2，14]．每年因?yàn)槟в筌浉《紩?huì)造成魔芋種植業(yè)的巨大損失，損失可達(dá)30%～50%，嚴(yán)重的達(dá)到80%以上，甚至絕收[2]．在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的魔芋軟腐病病原菌主要是屬于軟腐歐文氏菌屬(Erwinia)，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)[3-4]，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其在魔芋的栽培期及貯藏期均可發(fā)病，嚴(yán)重影響魔芋的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]．

化學(xué)防治在植物病蟲(chóng)害的防治中存在環(huán)境污染、易產(chǎn)生抗藥性等缺點(diǎn)[6]．相比之下，生物防治具有成本低、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性[7]等優(yōu)點(diǎn)，所以近些年成為防治熱點(diǎn)．其中植物內(nèi)生真菌在生物防治中具有十分重要的地位[8]，是能用來(lái)防治魔芋軟腐病的生物藥劑．該生物藥劑由解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液制成，具有一定的防治和增產(chǎn)作用[9]．本研究從花水疏花水柏枝(myricarialaxiflora)中分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌16-4，經(jīng)鑒定該內(nèi)生細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[10]．結(jié)果表明，平板對(duì)峙和模擬田間管理的植株實(shí)驗(yàn)，均可達(dá)到理想的防治效果．

1 材料與儀器

1.1 材料

疏花水柏枝的枝葉(三峽流域湖北宜昌境內(nèi)胭脂壩采集)，魔芋軟腐病病原菌(本研究室-80 ℃保藏)．

1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)全部使用牛肉膏蛋白胨(LB)培養(yǎng)基：1 L的水中加入5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化鈉，20 g瓊脂，pH 7.0～7.2．

1.3 試劑與主要儀器

50 μg/mL的鏈霉素溶液；75%乙醇；3%次氯酸鈉溶液；液氮；DNA凝膠回收試劑盒(Sangon公司)、通用引物27f、1492r；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶(日本、TaKaRa公司)．主要試驗(yàn)儀器見(jiàn)表1．

表1 主要儀器

2 方 法

2.1 魔芋拮抗菌的分離和篩選

2.1.1 魔芋拮抗菌的分離

在三峽流域湖北宜昌境內(nèi)胭脂壩采集疏花水柏枝的枝葉，清水洗凈之后用75%乙醇和3%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，采用稀釋平板法獲得內(nèi)生細(xì)菌．

制備稀釋液：無(wú)菌操作取約10 g樣品枝葉，加入無(wú)菌水100 mL，將組織研磨搗碎．取1.0 mL搗碎組織液加入無(wú)菌水9.0 mL，再用無(wú)菌水稀釋7個(gè)濃度梯度．

培養(yǎng)：取各濃度梯度稀釋液100 μL分別涂布于LB培養(yǎng)基平板中，恒溫37 ℃培養(yǎng)．

取單菌落：待平板上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)形態(tài)挑取單菌落于LB培養(yǎng)基平板中劃線(xiàn)培養(yǎng)，至長(zhǎng)出單一菌落，用甘油保藏于-80 ℃的低溫冰箱，記錄并編號(hào)．

2.1.2 魔芋拮抗菌的篩選

1)初篩．將保藏的魔芋軟腐病原菌用LB培養(yǎng)基的平板活化，37 ℃培養(yǎng)24 h，拮抗菌用同樣的方法活化；然后，挑取魔芋軟腐病原菌的單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h．之后，在無(wú)菌條件下取1 mL菌懸液加入100 mL LB固體培養(yǎng)基(45 ℃左右)混勻，倒入培養(yǎng)皿中，再用接種針挑取一環(huán)拮抗菌菌體點(diǎn)接在培養(yǎng)基表面，恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h．以50 μg/mL鏈霉素抑菌結(jié)果為對(duì)照，觀(guān)察抑菌作用．

2)復(fù)篩．操作步驟與初篩相同，選取初篩中效果較好的九株菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．觀(guān)察抑菌作用．

2.2 內(nèi)生細(xì)菌16-4的分子鑒定

將活化的16-4單菌落接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h．之后，菌懸液進(jìn)行離心，收集菌體后進(jìn)行液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取總DNA．

以總DNA為模板，以27f：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-GGTTACCTTGTTTACGACTT-3′為引物擴(kuò)增其16S rRNA基因[11]．PCR反應(yīng)在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系見(jiàn)表2．

表2 反應(yīng)體系 (單位：μL)

PCR進(jìn)行反應(yīng)，將其產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，選取1 500 bp左右的條帶進(jìn)行凝膠回收，送上海生工進(jìn)行測(cè)序分析，重復(fù)2次．

將測(cè)得的序列提交至GenBank，并獲得登錄號(hào)．再將此序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高(≥97%)的菌株的序列用MEGA4.1軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)手冊(cè)》[12]對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)，確定該菌序列屬性．

2.3 細(xì)菌16-4對(duì)魔芋軟腐病的拮抗作用

2.3.1 細(xì)菌16-4作用于魔芋塊的試驗(yàn)

取健康魔芋球莖,75%乙醇和次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌環(huán)境下切成魔芋塊，在魔芋塊表面切出一個(gè)大約2 cm×1 cm×0.5 cm的傷口，隨后將魔芋塊放入有少量無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．其中，A組魔芋塊為空白對(duì)照，不加任何物質(zhì)；B組魔芋塊中加1 mL無(wú)菌水；C組魔芋塊中加入1 mL病原菌培養(yǎng)液；D、E、F組魔芋塊中分別加入病原菌和16-4比例為1∶1、1∶2、1∶3的混合液；放置一周左右觀(guān)察情況．

2.3.2 細(xì)菌16-4作用于魔芋植株的試驗(yàn)

相同條件下健康生長(zhǎng)的魔芋植株均在魔芋植株靠近球莖的土壤上層部位開(kāi)一個(gè)小口，便于病原菌進(jìn)行侵染[13]．A組為空白對(duì)照，B組植株加100 mL病原菌培養(yǎng)液，C組植株加入100 mL病原菌培養(yǎng)液和100 mL 16-4培養(yǎng)液，D組植株加入100 mL病原菌培養(yǎng)液和300 mL 16-4培養(yǎng)液．4組植株在自然條件下生長(zhǎng)2周，期間適當(dāng)澆水，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果．

3 結(jié)果與分析

3.1 魔芋拮抗菌篩選結(jié)果

3.1.1 魔芋拮抗菌的初篩結(jié)果

從疏花水柏枝中分離得到的86株內(nèi)生細(xì)菌中共篩選到37株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)魔芋軟腐病病原菌具有拮抗作用．分別為：Y2-3，J3-1，J3-2，J3-8，J4-7，J5-2，J5-4，J6-7，3-3，3-4，4-1，4-2，5-1，5-3，5-4，5-6，6-1，6-2，7-3，7-4，8-2，8-3，8-4，8-6，10-2，10-3，12-1，14-1，16-3，16-4，17-1，17-2，18-1，18-2，18-3，ML1，MS1．

3.1.2 魔芋拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果

從初篩得到的37株疏花水柏枝內(nèi)生細(xì)菌中共篩選到11株對(duì)魔芋軟腐病病原菌具有拮抗作用．分別為：J5-4，J6-7，3-4，4-1，8-2，8-4，8-6，16-3，16-4，17-1，17-2．

11株內(nèi)生細(xì)菌中對(duì)魔芋軟腐病效果最好的一株菌是內(nèi)生細(xì)菌16-4，抑菌圈直徑可達(dá)75.4 mm．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示．

圖1 各菌株復(fù)篩結(jié)果

3.2 內(nèi)生細(xì)菌16-4的鑒定

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈米白色，表面較干燥，單菌落較小且呈圓形(圖2A和B)，菌體在液體中易分散，不產(chǎn)生色素．顯微形態(tài)表明，菌體為直桿狀，菌體體積較大，分布較緊密．經(jīng)革蘭氏染色后顯紫色，其屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(圖2C)．

提取16-4的總DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收的產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序．將獲得16S rDNA的ITS序列通過(guò)EditSeq軟件拼接，把序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)KP072784．選擇與GenBank收錄的同源性比較高的序列與所獲得序列，用Blast與進(jìn)行比對(duì)和同源性行分析，再用MEGA5.0做進(jìn)化樹(shù)(圖2D)．結(jié)果表明：鑒定菌株(16-4)16S rDNA的ITS序列與一株蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisKF687051)的同源性達(dá)97%，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)手冊(cè)》，比較分析該菌株和蘇云金芽孢桿菌的形態(tài)特征，所以確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌，命名為16-4．

A：菌落形態(tài)； B：背面形態(tài)； C：顯微形態(tài)； D：系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖2 16-4的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)以及分子鑒定

3.3 16-4對(duì)魔芋軟腐病的拮抗作用

3.3.1 細(xì)菌16-4作用于魔芋塊的試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用病原菌和16-4不同比例的混合培養(yǎng)液作用于魔芋塊，做一組空白對(duì)照，一組無(wú)菌水作為負(fù)對(duì)照，4組實(shí)驗(yàn)組，得到結(jié)果如圖3所示．從圖3能夠看出，單接無(wú)菌水的魔芋塊(圖3B)為出現(xiàn)輕微變質(zhì)的跡象，單接魔芋軟腐病的魔芋塊(圖3C)出現(xiàn)嚴(yán)重變軟變黑的現(xiàn)象，而且伴有惡臭的味道．比較6個(gè)圖片(圖3)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出加了16-4培養(yǎng)液能夠抑制魔芋軟腐病，但是明顯等量添加(圖3D)的效果不夠，需要大量添加(圖3E和F)才有徹底抑制的可能．

A：空白對(duì)照； B：魔芋塊中加1 mL無(wú)菌水； C：魔芋塊中加入1 mL病原菌培養(yǎng)液； D：魔芋塊中加0.5 mL病原菌培養(yǎng)液和0.5 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液； E：魔芋塊中加0.33 mL病原菌培養(yǎng)液和0.67 mL 16-4培養(yǎng)液混合液； F：魔芋塊加0.25 mL病原菌培養(yǎng)液和0.75 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液圖3 細(xì)菌16-4作用于魔芋塊的效果

3.3.2 細(xì)菌16-4作用于魔芋植株的試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用病原菌液和不同比例的病原菌和16-4培養(yǎng)液的混懸液澆灌于健康的魔芋植株，生長(zhǎng)2周后得到結(jié)果如圖4所示．

A：健康植株； B：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液； C：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液和100 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液； D：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液和300 mL 16-4培養(yǎng)液； E：魔芋植株整體比較圖4 細(xì)菌16-4作用于魔芋植株的效果

由于魔芋軟腐病能夠侵染有傷口的魔芋植株，所以實(shí)驗(yàn)中的魔芋植株都在接近根的莖部位開(kāi)了一個(gè)小傷口，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康植株(圖4A)相比較只加了病原菌的植株就變得枯黃、打蔫(圖4B)，另外兩組魔芋植株由于加了細(xì)菌16-4的發(fā)酵液，植株依然在生長(zhǎng)(圖4C和D)，但是第2棵魔芋比第3棵長(zhǎng)得慢．繼續(xù)培養(yǎng)約1個(gè)星期后，將死亡植株(圖4B)挖出發(fā)現(xiàn)球莖壞死(圖4E1)，特別是在傷口部位已經(jīng)干枯，推測(cè)死亡原因是由于魔芋軟腐病入侵導(dǎo)致傷口部位軟爛無(wú)法傳送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而使植株干枯死亡．另外兩組魔芋植株植株依然在生長(zhǎng)(圖4C和D)，而且在傷口部位沒(méi)有什么明顯變化(圖4E2和E3)．由此可以看出，魔芋軟腐病對(duì)魔芋的生長(zhǎng)有著致命的作用，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌16-4對(duì)于魔芋軟腐病具有很強(qiáng)的拮抗作用，能有效抑制魔芋軟腐病病原菌的生長(zhǎng)．

4 討 論

實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)分離篩選得到的86株疏花水柏枝的內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙法發(fā)現(xiàn)有37株對(duì)魔芋軟腐病有抑制作用，復(fù)篩之后發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌16-4的抑制作用最好，抑菌圈可達(dá)75.4 mm．利用16-4進(jìn)行魔芋塊和植株的實(shí)驗(yàn)，也表明16-4對(duì)魔芋軟腐病的確有很強(qiáng)的抑制作用，特別是在植株作用實(shí)驗(yàn)上，說(shuō)明可以直接利用16-4的菌懸液來(lái)防止魔芋軟腐病，降低其發(fā)病率；從生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)可以節(jié)約成本；從使用方面來(lái)說(shuō)應(yīng)用起來(lái)很方便．但從科研角度來(lái)說(shuō)，有必要明確其拮抗機(jī)理，所以還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究，分析是何種物質(zhì)產(chǎn)生的抑制效果．