孫英堯，董 浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)是一種十分罕見(jiàn)的病毒，它是在1976年同時(shí)暴發(fā)的兩起疫情中首次出現(xiàn)的，一起在現(xiàn)在的南蘇丹恩扎拉，另一起在剛果民主共和國(guó)揚(yáng)布庫(kù)。后者發(fā)生在位于埃博拉河附近的一處村莊，該病由此得名。感染埃博拉出血熱(Ebola virus disease, EVD)通常潛伏期為4～10 d，初期癥狀與流感類似，表現(xiàn)為嘔吐與腹瀉，隨后身體內(nèi)外出血，伴隨有突發(fā)休克，最后是多器官衰竭。病人一般在出現(xiàn)癥狀后的6～16 d死亡。盡管目前已研發(fā)了一些疫苗可對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行防護(hù)，但我們對(duì)埃博拉病毒的了解還不夠。本文就埃博拉病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展作一綜述，以期為更深入的研究提供參考。

1 埃博拉病毒的分類學(xué)地位

埃博拉病毒屬于單股反意病毒目(Mononegavirales)絲狀病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒屬(Ebolavirus)。該屬又包含5個(gè)種：本迪布焦埃博拉病毒(BundibugyoEbolavirus，BEBOV)、雷斯頓埃博拉病毒(RestonEbolavirus，REBOV)、蘇丹埃博拉病毒(SudanEbolavirus，SEBOV)、大森林型埃博拉病毒(TaiForestEbolavirus；IvoryCoastEbolavirus，ICEBOV)、扎伊爾型埃博拉病毒(ZaireEbolavirus，ZEBOV)。絲狀病毒科下還有兩個(gè)屬，為馬爾堡病毒(Marburgvirus，MAEV)與奎瓦病毒(Cuevavirus)[1]。

2 埃博拉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展

埃博拉病毒(圖1)直徑80 nm，長(zhǎng)度為970～1200 nm，進(jìn)入細(xì)胞后病毒的長(zhǎng)度可達(dá)14000 nm[2]。埃博拉病毒的反意基因長(zhǎng)達(dá)19 kb，基因組呈線狀，無(wú)分段，包含有7個(gè)基因與兩個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)段。兩個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)段位于3’頭端與5’尾端。3’頭端有雙向復(fù)制的啟動(dòng)子，也是第一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。5’尾端編碼復(fù)制啟動(dòng)子的互補(bǔ)序列[3]。7個(gè)基因分別對(duì)應(yīng)編碼埃博拉病毒的7種病毒蛋白，分別為：核蛋白(nucleoprotein，NP)、糖蛋白(glycoprotein，GP)、L聚合酶蛋白(L-polymerase protein，L)、病毒蛋白24(viral protein24，VP24)、病毒蛋白30(viral protein30，VP30)、病毒蛋白35(viral protein35，VP35)與病毒蛋白40(viral protein40，VP40)[4]。7種蛋白的分子生物學(xué)特征綜述如下：

圖1 埃博拉病毒電鏡照片[5]Fig 1 Electron microscope photography of Ebola virus[5]

2.1 病毒蛋白24(VP24) VP24是絲狀病毒的常見(jiàn)蛋白。以往的研究表明，該蛋白的功能是抑制宿主機(jī)體產(chǎn)生α、β與γ干擾素，阻礙干擾素基因的翻譯過(guò)程。VP24能夠通過(guò)結(jié)合真核細(xì)胞核孔的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及抑制KappaB(NF-KB)通路來(lái)阻止編碼干擾素基因的轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與磷酸化過(guò)程[6]。

VP24也是病毒組裝衣殼的重要蛋白，它增強(qiáng)了不同結(jié)構(gòu)蛋白之間的協(xié)同催化作用。通過(guò)觀察C、N末端缺失的VP24，發(fā)現(xiàn)N末端編碼的VP24具有調(diào)控衣殼蛋白形成的作用[7]，說(shuō)明VP24在病毒衣殼合成過(guò)程中起的作用應(yīng)該為催化作用或者為調(diào)控VP35與NP。另有研究表明，VP24與VP40的共同表達(dá)能夠形成大量的類病毒粒子(VLPs)，遠(yuǎn)比VP40單獨(dú)表達(dá)時(shí)多得多，推測(cè)可能是VP24的小干擾RNA(siRNA)降低了病毒的釋放量，使大量的病毒蛋白保留在被感染的細(xì)胞內(nèi)。此外還有研究表明，VP24結(jié)合在VP35的病毒衣殼外表面，起到了調(diào)節(jié)NP層、增強(qiáng)衣殼機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定性的作用，增強(qiáng)了NP、VP35、VP24的協(xié)同關(guān)系[8]。

2.2 病毒蛋白35(VP35) VP35的主要作用是影響宿主的免疫系統(tǒng)，使病毒免于被宿主的免疫機(jī)制清除。VP35是1型干擾素的拮抗物，通過(guò)與雙鏈RNA結(jié)合抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3，同時(shí)抑制1型干擾素RIG-1的信號(hào)傳導(dǎo)從而降低α型與β型干擾素的生成[9]。VP35還能通過(guò)多種途徑影響宿主整體的免疫系統(tǒng)。VP35通過(guò)增加活躍的STAT1(轉(zhuǎn)錄活化蛋白1)調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子7的活性，抑制干擾素生成toll樣受體與RIG-1的活性。已有證據(jù)表明，VP35還可以解除RNA沉默，可以使先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)與宿主的抗病毒反應(yīng)失效[10]。

此外，VP35也有協(xié)助病毒復(fù)制的功能。VP35的C末端可以結(jié)合雙鏈RNA，而N末端可以結(jié)合NP。當(dāng)VP35的N末端與NP解離時(shí)，NP會(huì)活化，隨后與病毒RNA結(jié)合，高度激活基因組的轉(zhuǎn)錄活性，隨后的NP解離，并出現(xiàn)寡聚現(xiàn)象，形成寡聚NP。但NP單體并沒(méi)有寡聚的傾向，僅在上述的生化反應(yīng)中才會(huì)出現(xiàn)寡聚。此外，其他病毒中VP35與NP的作用反而會(huì)降低NP的寡聚化。對(duì)這一現(xiàn)象的研究可能是研發(fā)治療埃博拉出血熱的突破口。

2.3 病毒蛋白30(VP30) VP30是埃博拉病毒的一種次要核蛋白質(zhì)，主要作用是起始病毒基因組的轉(zhuǎn)錄，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)磷酸化過(guò)程[11]。最新的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，VP30還具有解除RNA干擾的功能，但是具體機(jī)制尚不明確。當(dāng)存在siRNA時(shí)，VP30會(huì)影響主要參與RNA干擾的蛋白的帽子結(jié)構(gòu)，這時(shí)即使是VP35的N末端RNA結(jié)合域已經(jīng)結(jié)合，但VP30的干涉仍會(huì)啟動(dòng)。這表明VP30蛋白的RNA結(jié)合功能非常廣泛，而且不止限定于宿主或者病毒自身的RNA，似乎存在一定的堿基結(jié)構(gòu)選擇性，但是這一功能是否為病毒RNA轉(zhuǎn)錄所必須的，目前尚不可知。

2.4 病毒蛋白40(VP40) VP40是病毒組裝的基石[12]，其主要作用是形成六聚物——這一結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是埃博拉病毒衣殼的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，功能為埃博拉基因組復(fù)制與RNA的結(jié)合[13]。

以往的研究多針對(duì)于該蛋白作用調(diào)節(jié)生成VLPs，而最近的研究表明，VP40還可以產(chǎn)生外泌體結(jié)構(gòu)，殺死免疫細(xì)胞。外泌體的出現(xiàn)一般是在病毒感染細(xì)胞之后， VP40導(dǎo)致的外泌體接觸到未成熟的T細(xì)胞和單核白血球細(xì)胞后，會(huì)引起這兩者的凋亡及活性下降。關(guān)于VP40在致病機(jī)制中的作用，有可能是開(kāi)發(fā)新治療手段的切入點(diǎn)。已有研究用酪氨酸磷酸激酶對(duì)其進(jìn)行酪氨酸殘基加聚磷酸基團(tuán)，降低VP40的活性。還有使用氧四環(huán)素作為其他治療手段[4]，它可以導(dǎo)致VP40相關(guān)的分泌小體減少，并顯著降低接受了分泌小體的受體細(xì)胞的生存能力，這一成果對(duì)治療埃博拉出血熱有著很大的研發(fā)空間。

2.5 糖蛋白(GP) GP是埃博拉病毒蛋白中最主要的毒性蛋白。GP并非指單獨(dú)的GP糖蛋白，而是由編碼GP基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄編輯形成的三種產(chǎn)物的總稱：其包括全長(zhǎng)的GP蛋白(包含GP1受體結(jié)合域，GP2病毒融合域兩個(gè)亞基)；可溶性GP(sGP，缺少橫跨膜域)與小可溶GP(ssGP)。sGP上存在福林酶位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)福林酶處理后的sGP可以產(chǎn)生一個(gè)碎片片段稱為△-肽[14]。

GP與病毒感染細(xì)胞的途徑密切相關(guān)。通過(guò)GP介導(dǎo)的胞飲作用，GP會(huì)將病毒與宿主細(xì)胞的前溶酶體結(jié)構(gòu)相融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞。在毒性方面，GP通過(guò)黏蛋白類似域影響細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，降低了ERK2的磷酸化作用與催化活性，降低宿主細(xì)胞的粘附性，使細(xì)胞剝離且不能維持正常的球形，繼而使細(xì)胞死亡[15]。此外，sGP的碎片產(chǎn)物△-肽有可能還扮演著埃博拉病毒致病機(jī)理中病毒孔蛋白的作用，其可以在哺乳動(dòng)物的原生質(zhì)膜上形成孔道，增加離子通透性，破壞細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境平衡[16]。

GP作為位于病毒衣殼表面的蛋白，與埃博拉病毒的侵染選擇性也有很深的淵源。在2014-2016年的西非埃博拉出血熱爆發(fā)中，檢測(cè)到的埃博拉病毒的GP蛋白在A82V中的高頻變異。這一變異增加了GP的膜融合活性，并且使得大量其他型的細(xì)胞變得可以被侵染：包括黑猩猩的纖維母細(xì)胞(S008842)、恒河猴上皮細(xì)胞(FRhK4)、非洲綠猴上皮細(xì)胞(Vero)以及人樹(shù)突細(xì)胞。這一信息表明新種埃博拉病毒已經(jīng)開(kāi)始高度適應(yīng)人類作為宿主[17-18]。

2.6 核蛋白(NP) NP是埃博拉病毒的復(fù)制循環(huán)中的重要蛋白——核糖核蛋白復(fù)合物的亞基，其主要功能是保護(hù)病毒RNA免于被降解，保證病毒基因組在裝配過(guò)程中正確進(jìn)入到病毒粒子的衣殼中。目前NP的新功能并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

2.7 聚合酶蛋白(L) L是依賴RNA的RNA聚合酶，是病毒多聚酶復(fù)合物的元件之一。主要功能是病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過(guò)程中對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與翻譯，但是L作為一種病毒的RNA聚合酶，其功能與真核細(xì)胞的RNA聚合酶差異很大。以GP基因?yàn)槔?，L將其翻譯的結(jié)果是sGP而不是GP[19]。L的翻譯也是實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)GP、sGP、ssGP不同水平的原因。在連續(xù)培養(yǎng)的組織細(xì)胞中，L被發(fā)現(xiàn)能夠在GP基因中連續(xù)的7個(gè)U中再添加一個(gè)U，從而調(diào)節(jié)GP與sGP的表達(dá)比率為80∶20。在豚鼠的實(shí)驗(yàn)中，該基因回復(fù)突變?cè)俅问惯@個(gè)基因又變回了7個(gè)U，導(dǎo)致GP∶sGP=20∶80[20]。這一特點(diǎn)有可能是病毒進(jìn)行免疫回避的一種獨(dú)特手段。作為對(duì)比，在人的肝癌細(xì)胞系(Hun7)中的病毒復(fù)制則是一個(gè)該基因?yàn)?U的變異體，其保持了高水平的sGP表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)的還有ssGP的表達(dá)。通過(guò)豚鼠與人肝癌細(xì)胞的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中不難發(fā)現(xiàn)L除了翻譯的功能之外，還存在有調(diào)節(jié)GP與GP相關(guān)蛋白比例的功能。這一現(xiàn)象據(jù)推測(cè)可能與病毒為了適應(yīng)不同的宿主而進(jìn)行的調(diào)節(jié)有關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)的快速?gòu)?fù)制。

3 結(jié) 語(yǔ)

埃博拉出血熱目前尚無(wú)有效的治療手段。對(duì)埃博拉疫苗的研究始于2004年，由美國(guó)衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(State Department of Health and Human Services)發(fā)起的Project Bioshield，最終于2014年推出了能夠100%保護(hù)的疫苗，這為后來(lái)的埃博拉病毒疫苗提供了模板。隨后的口腔炎病毒(rVSV)與扎伊爾埃博拉病毒(ZEBOV)糖蛋白的重組病毒(rVSV-ZEBOV)疫苗在2016年的埃博拉疫情中效果顯著，但是仍然有患者在痊愈后1～2年中抗體顯著下降，有著復(fù)發(fā)的潛在危險(xiǎn)[21]。目前來(lái)看，針對(duì)于埃博拉出血熱的疫苗開(kāi)發(fā)形式仍然嚴(yán)峻。