姜輝，王永翠，高明偉，王秀麗，陳瑩，王家寶，柴啟超，張超，趙軍勝

（山東棉花研究中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點(diǎn)試驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要方面，可為育種家在種質(zhì)創(chuàng)新和親本選配過程中提供有力參考，使雜交親本的選擇更有針對(duì)性，能極大提高雜交后代育種選擇效率。在眾多用于遺傳多樣性分析的標(biāo)記中，DNA 分子標(biāo)記作為不受環(huán)境影響的中性標(biāo)記，應(yīng)用最為廣泛，基于DNA 分子標(biāo)記的分析方法成為種質(zhì)資源遺傳背景評(píng)價(jià)分析的重要手段[1-3]。其中，微衛(wèi)星標(biāo)記（Simple sequence repeat，SSR）因具有易開發(fā)、多態(tài)性好、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析[4-14]。棉花分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫CMD（Cotton Marker Database） 曾經(jīng)公布的棉花SSR 標(biāo)記有17 448個(gè)；陸地棉測(cè)序后，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花所公布了77 996個(gè)棉花基因組SSR 標(biāo)記[15]，均為棉花種質(zhì)的遺傳多樣性分析提供了大量的分子標(biāo)記。但研究表明，棉花遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，大量SSR標(biāo)記在種質(zhì)資源中無多態(tài)性或者多態(tài)性較低[16-23]。在大量分子標(biāo)記中快速高效地篩選出多態(tài)性較好的分子標(biāo)記，是基于SSR 標(biāo)記分析遺傳多樣性的基礎(chǔ)，對(duì)提高棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析效率具有重要意義。

本研究擬對(duì)改良DNA 混合池法在棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析SSR 標(biāo)記快速篩選中的應(yīng)用進(jìn)行探討，并對(duì)篩選標(biāo)記的使用效果進(jìn)行初步驗(yàn)證，為棉花種質(zhì)親緣關(guān)系分析過程中多態(tài)性SSR 標(biāo)記的快速篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

60個(gè)棉花基因組SSR 標(biāo)記從CMD 網(wǎng)站下載的文件中隨機(jī)挑選，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；40 份不同的棉花種質(zhì)材料由山東棉花研究中心遺傳育種室保存提供。

1.2 方法

1.2.1DNA 混池的制作。將40 份種質(zhì)隨機(jī)排列，編號(hào)1～40。5個(gè)樣品1個(gè)混池，混池編號(hào)依次為P1～P8，P1包含材料1～5，P2包含材料6～10，依次類推；每個(gè)混合池的第1 樣品作為各自的對(duì)照。

1.2.2DNA 提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)。棉花基因組DNA 提取方法參照文獻(xiàn)[24]；PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括Promega 5×Green buffer 2 μL，10 μmol·L－1dNTPs 0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL；PCR 在T100 型梯度PCR 儀（美國伯樂公司）上運(yùn)行，程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min，12 ℃保存。

1.2.3多態(tài)性標(biāo)記的選擇。PCR 產(chǎn)物在8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的聚丙烯酰胺凝膠上分離，并用快速銀染法染色。比較混合池與對(duì)照間的差異，將差異標(biāo)記進(jìn)一步用于單樣品的多態(tài)性分析。

1.2.4帶型判讀及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)標(biāo)記帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，陽性帶型為1，陰性帶型為0，遺傳多樣性分析軟件為NTsys2.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記多態(tài)性篩選

經(jīng)過DNA 混合池篩選，不同分子標(biāo)記在混合池間的差異表現(xiàn)不同。在60個(gè)SSR 標(biāo)記中，20個(gè)分子標(biāo)記在8個(gè)混池之間表現(xiàn)出差異（表1），所占比例為33.3%。多態(tài)性標(biāo)記在混池中差異不盡相同，其中BNL1053、MON5553 等7個(gè)標(biāo)記在8個(gè)混合池內(nèi)都表現(xiàn)出差異；MON0613、BNL3031、BNL827 等6個(gè)標(biāo)記在7個(gè)混合池中表現(xiàn)出差異；而MON0362 和MON296 僅在3個(gè)混池中表現(xiàn)出差異。

2.2 分子標(biāo)記多態(tài)性驗(yàn)證

為檢驗(yàn)該混合池法篩選差異SSR 分子標(biāo)記的可靠性，用60個(gè)標(biāo)記分別對(duì)40個(gè)樣品單樣進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)于20個(gè)有差異的標(biāo)記而言，單樣品檢測(cè)中均表現(xiàn)出不同程度的差異，參見圖1（BNL2449 在8個(gè)混池中的標(biāo)記帶型）和圖2（BNL2449 在部分單樣品的標(biāo)記帶型）。對(duì)于40個(gè)在8個(gè)混合池間及對(duì)照間沒有表現(xiàn)出差異的標(biāo)記而言，在單樣品的檢測(cè)中也沒有發(fā)現(xiàn)差異，參見圖3和圖4（BNL3264 在混池和單樣品中的檢測(cè)結(jié)果）。

表1 20個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記在8個(gè)混合池中的多態(tài)性表現(xiàn)

圖1 BNL2449 在混池間的標(biāo)記帶型

圖2 BNL2449 在部分單樣品的標(biāo)記帶型

圖3 BNL3264 在混池間的標(biāo)記帶型

圖4 BNL3264 在部分單樣品的標(biāo)記帶型

2.3 混池篩選的分子標(biāo)記對(duì)遺傳多樣性分析的影響

為了驗(yàn)證混合池篩選出的標(biāo)記在遺傳多樣性中分析的效果，分別挑選了在混合池篩選中差異較大的5個(gè)標(biāo)記BNL1053、MON5553、MON022、NAU1043、NAU2083 和差異較小的5個(gè)標(biāo)記MON296、MON0362、NON0707、NAU802 和NAU808，根據(jù)2組標(biāo)記在40樣品中的多態(tài)性數(shù)據(jù)，用NTsys 軟件進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖5和圖6所示。結(jié)果顯示圖5在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)可以明顯地將40份材料分為3 類，而圖6中遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)，40份材料才分成兩大類，并有很大一部分種質(zhì)材料無差異，這說明在遺傳多樣性分析中可優(yōu)先選擇在混合池中差異較大的標(biāo)記用于種質(zhì)的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。

3 討論與結(jié)論

基于SSR 標(biāo)記的遺傳多樣性分析中，標(biāo)記多態(tài)性是無法預(yù)判的，只能通過單樣品檢測(cè)才能了解，而且有關(guān)提高棉花SSR 標(biāo)記篩選效率方法的研究較少。王欣怡等[20]提出通過查閱系譜，找出8份親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料對(duì)586 對(duì)候選引物進(jìn)行初篩，得到190 對(duì)初篩引物，用于下一步的遺傳多樣性分析。這種方法雖然在一定程度上提高了多態(tài)性標(biāo)記的預(yù)篩效率，但是需要了解部分種質(zhì)的系譜信息，這極大限制了其用于系譜信息不全的種質(zhì)的分析。此外，基于部分種質(zhì)的預(yù)篩會(huì)遺漏大部分遺傳信息。本研究將改良DNA 混池法用于遺傳多樣性標(biāo)記的預(yù)篩，包含了所有分析材料的遺傳信息。結(jié)果表明，該法可有效提高棉花SSR 標(biāo)記的篩選效率，可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)將多態(tài)性較好的標(biāo)記用于遺傳多樣性分析當(dāng)中，同時(shí)極大降低試驗(yàn)成本。

圖5 基于多態(tài)性較好的SSR 標(biāo)記的遺傳聚類分析

圖6 基于多態(tài)性較差的SSR 標(biāo)記的遺傳聚類分析

雖然混池法可提高標(biāo)記的預(yù)篩效率[25]，但在不加對(duì)照的情況下，無法顯示池內(nèi)的多態(tài)性，只能根據(jù)混池之間的帶型不同選擇標(biāo)記，容易丟失部分多態(tài)性標(biāo)記。本研究提出嘗試在DNA 混合池構(gòu)建過程中，每個(gè)池選擇1個(gè)隨機(jī)對(duì)照，通過增加不同對(duì)照，減少多態(tài)性標(biāo)記漏篩的概率。通過本研究的驗(yàn)證，經(jīng)過不同混合池與不同對(duì)照的兩兩比對(duì)，可有效提高多態(tài)性標(biāo)記的預(yù)篩效率。如圖1 所示，以P2和P3 為例，通過各自的對(duì)照6 和11，可知2個(gè)混池內(nèi)均具有多態(tài)性。池內(nèi)多態(tài)性越好的標(biāo)記，其分析效果越好。

本試驗(yàn)由于所用的材料相對(duì)較少，因此采用5個(gè)樣品混池的方法。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可針對(duì)試驗(yàn)材料數(shù)量的不同，對(duì)每個(gè)混池中的樣品數(shù)量進(jìn)行調(diào)整。此外，本方法的反應(yīng)條件還需要進(jìn)一步優(yōu)化。