徐俊民，崔興雷，劉玉玲，彭仁海，周忠麗，蔡小彥，王坤波，劉方*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000；2.安陽(yáng)工學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000）

棉屬共有8個(gè)二倍體基因組，分別是A、B、C、D、E、F、G和K組，這8個(gè)二倍體基因組間大小差異明顯，其中K 基因組最大（2 460 Mbp），D基因組最?。?80 Mbp）[1-2]。棉花的主要栽培種陸地棉和海島棉是由A 基因組祖先和D 基因組祖先雜交后染色體加倍形成的異源四倍體。研究棉花A、D 基因組的差別將有助于了解棉花基因組的起源進(jìn)化和結(jié)構(gòu)關(guān)系，也將有助于棉花育種的研究進(jìn)程。

重復(fù)序列按照其分布類型可以分為串聯(lián)型重復(fù)序列和彌散型重復(fù)序列[3]。串聯(lián)型重復(fù)序列有一定的拷貝數(shù)，一般比較保守，在染色體或基因組上成串分布。彌散型重復(fù)序列在基因組中彌散分布，在高等植物基因組中占的比例很大，在多倍體植物中所占比例更高，有的在50%以上。重復(fù)序列在基因組中的擴(kuò)增會(huì)引起基因突變，導(dǎo)致明顯的形態(tài)變化，甚至引起數(shù)量性狀的變化[4]。

對(duì)棉花A和D基因組比較研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列含量的不同是造成2個(gè)基因組巨大差異的主要因素[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列在棉花基因組間存在擴(kuò)散和互滲現(xiàn)象，尤其是四倍體中從A基因組向D基因組的擴(kuò)散，Wendel將這種現(xiàn)象稱為“基因組的殖民化”[7-9]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）引物NAU1201在海島棉細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）文庫(kù)中篩選到1個(gè)含有重復(fù)序列的克隆299N22，研究發(fā)現(xiàn)該克隆所含有的重復(fù)序列可能對(duì)棉花基因組的研究有較大的價(jià)值[10]。本研究利用該SSR 引物分別在阿非利加棉文庫(kù)和達(dá)爾文氏棉文庫(kù)篩選出3個(gè)和1個(gè)陽(yáng)性BAC 克隆，用篩選出的BAC 克隆作探針，進(jìn)行熒光原位雜交（Fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）試驗(yàn)，并與之前在海島棉篩選到的BAC 克隆所產(chǎn)生的FISH 結(jié)果[10]比較。

1 材料與方法

1.1 引物和BAC文庫(kù)

SSR 引物NAU1201 被用來(lái)篩選阿非利加棉BAC 文庫(kù)[11]和達(dá)爾文氏棉BAC 文庫(kù)。阿非利加棉BAC 文庫(kù)共有75 000個(gè)克隆，共覆蓋阿非利加棉基因組5 倍，插入片段長(zhǎng)度集中在100～150 kbp，平均115 kbp，插入片段空載率小于4%。達(dá)爾文氏棉BAC 文庫(kù)含200 832個(gè)克隆，共覆蓋達(dá)爾文氏棉基因組10 倍，插入片段長(zhǎng)度平均為122 kbp，空載率小于2%。引物NAU1201 的序列信息來(lái)自于網(wǎng)站www.cottonmarker.org，正向引物序列： CCGATAT-CTTACTTTCCAACCT，反向引物序列：AAGGGG-TTTGAAGGGTTATC。

1.2 棉種材料

所選靶染色體為陸地棉、亞洲棉及雷蒙德氏棉的根尖有絲分裂中期染色體。這些材料在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的溫室均有活株，并有充裕的種子以供育苗提供根尖。采用宋國(guó)立等[12]改良的CTAB 法提取各棉種的基因組DNA。

1.3 BAC文庫(kù)的篩選

BAC 文庫(kù)的篩選采用三步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）篩選法進(jìn)行[13]。挑取篩選出的陽(yáng)性單克隆培養(yǎng)，并用十二烷基磺酸鈉- 堿裂解法[14]提取質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的SSR 引物擴(kuò)增以驗(yàn)證所提取質(zhì)粒的質(zhì)量。菌液PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，DNA 模板1 μL，dNTPs（0.01 mol·L－1）1.5 μL，上下游引物（1×10－5mol·L－1）各1 μL，TaqDNA 聚合酶終濃度0.025 U·μL－1，10×Reaction buffer 2.0 μL，然后用水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性40 s，55℃退火40 s，72 ℃延伸1 min ，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min，4 ℃保存。

1.4 熒光原位雜交

種子在溫水中浸泡過(guò)夜，播種于經(jīng)煮沸消毒的潮濕的細(xì)沙中，置于光照培養(yǎng)箱中待其萌發(fā)。待根長(zhǎng)至1～3 cm 時(shí)取根尖，浸泡于25 mg·L－1的放線菌酮中，22 ℃預(yù)處理1 h 40 min，然后用蒸餾水漂洗2 次，最后用卡諾固定液（乙醇與冰乙酸體積比為3∶1）固定2 h 以上。用4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）纖維素酶（Cellulase R-10，Sigma） 和2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 果膠酶（Pectinase，Sigma） 混合液在37 ℃下處理根尖40 min，用60%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸壓片，隨后－80 ℃放置4 h 以上，最后揭片，4 ℃保存。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用德國(guó)Roche 公司的Bio-Nick Translation 標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記，按照其標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作。熒光原位雜交流程按照Cui 等[10,15]的方法。雜交完成后在熒光顯微鏡（Ziess Axioskop2 plus） 下觀察熒光雜交信號(hào)，用Isis 軟件拍攝照片并調(diào)節(jié)對(duì)比度和亮度。保存FISH 照片，用Photoshop 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

用SSR 引物NAU1201 分別對(duì)達(dá)爾文氏棉和阿非利加棉基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致。利用三步PCR 法分別篩選阿非利加棉和達(dá)爾文氏棉BAC 文庫(kù)，在阿非利加棉文庫(kù)中篩選出3個(gè)BAC 克隆125C20、28D13 和28D15，在達(dá)爾文氏棉文庫(kù)中篩選出1個(gè)BAC 克隆42D12（圖1）。

圖1 SSR 標(biāo)記NAU1201 在達(dá)爾文氏棉和阿非利加棉BAC 文庫(kù)的篩選結(jié)果

分別用阿非利加棉的28D13 克隆和達(dá)爾文氏棉的42D12 BAC 克隆為探針，以陸地棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉的有絲分裂中期染色體為靶DNA 進(jìn)行熒光原位雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所篩選的BAC 克隆在A（亞）組所有的染色體上都有彌散分布的信號(hào)，而在D（亞）組所有的染色體上幾乎沒(méi)有雜交信號(hào)（圖2，參見(jiàn)封三），該結(jié)果與在海島棉篩選到的BAC 克隆299N22 所產(chǎn)生的FISH 結(jié)果[10]一致。

3 討論與結(jié)論

本研究以本實(shí)驗(yàn)室在海島棉BAC 文庫(kù)中篩選到的1個(gè)BAC 克隆為探針，對(duì)不同棉種的有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)其在A（亞）組所有的染色體上都有強(qiáng)烈的彌散分布的信號(hào)，而在D（亞）組所有的染色體上幾乎沒(méi)有雜交信號(hào)[10]。測(cè)序發(fā)現(xiàn)該BAC 克隆中含有1種重復(fù)序列[16]，研究該重復(fù)序列對(duì)理解棉屬的進(jìn)化有很重要的意義。本研究通過(guò)相同的引物來(lái)篩選阿非利加棉和達(dá)爾文氏棉BAC 文庫(kù)，均獲得了相應(yīng)的BAC 克?。▓D2，參見(jiàn)封三）。這些克隆的獲得為研究該重復(fù)序列在不同棉種的分布情況以及在不同棉種中的序列差異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 BAC克隆在不同棉種染色體上的FISH定位

本試驗(yàn)用同一個(gè)SSR 引物在3個(gè)棉花BAC文庫(kù)中篩選到相似的BAC 克隆，說(shuō)明該目標(biāo)區(qū)域在這3個(gè)棉種基因組中保守性較強(qiáng)。相同的FISH雜交信號(hào)說(shuō)明BAC 克隆中的這個(gè)重復(fù)序列在A基因組和A 亞組分布有一致性，該重復(fù)序列在異源四倍體形成后沒(méi)有“入侵”D 亞基因組，其大量擴(kuò)增應(yīng)該發(fā)生在異源四倍體棉種形成前。上述結(jié)果為含有A（亞）組特殊重復(fù)序列的BAC 克隆的獲得，研究該特殊重復(fù)序列在不同棉種基因組中的分布及進(jìn)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

重復(fù)序列在棉花的基因組間表現(xiàn)出明顯的特異性，其在基因組中的擴(kuò)增對(duì)棉屬的進(jìn)化起到了十分重要的作用[17]。本試驗(yàn)中這些BAC 克隆的發(fā)現(xiàn)將對(duì)研究棉花基因組結(jié)構(gòu)以及棉花A、D 基因組的起源進(jìn)化提供幫助，也將有助于推動(dòng)棉花的比較基因組學(xué)研究。