李 銳，徐金梅，孫衛(wèi)東，鄔向東

(河南中帥醫(yī)藥科技股份有限公司，河南 鄭州 450001)

艾司奧美拉唑鈉(Esomeprazole sodium)，化學(xué)名為5-甲氧基-2-[(S)-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亞硫?；鵠-1H-苯并咪唑鈉鹽，由阿斯利康公司研發(fā)，并于2000年、2001年、2003年分別在瑞典、美國(guó)和歐盟以及中國(guó)批準(zhǔn)上市[1-3]。該物質(zhì)是一種質(zhì)子泵抑制劑(Proton pump inhibitor，PPI)，可通過(guò)與胃壁細(xì)胞H、K-ATP酶共價(jià)結(jié)合，抑制該酶的活性、胃酸的分泌，普遍應(yīng)用于胃食管返流病、消化性潰瘍等酸相關(guān)性疾病的治療，且療效較好[4-5]。

基因毒性雜質(zhì)在很低的濃度下可誘導(dǎo)基因突變導(dǎo)致染色體斷裂和重排，具有潛在的致癌性[6-7]，現(xiàn)已引起研究者廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外已有很多利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-11]檢測(cè)藥物中基因毒性雜質(zhì)的報(bào)道。艾司奧美拉唑鈉合成過(guò)程中用到過(guò)氧化物體系[1]，在氧化反應(yīng)時(shí)可能生成副產(chǎn)物奧美拉唑氮氧物(Omeprazole N-oxide，GTI E)及奧美拉唑氮氧磺酰物(Omeprazole sulfonylate N-oxide，GTI I)，二者均具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)片段N-氧化芳香環(huán)結(jié)構(gòu)[12](表1)，依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則[13]，兩者均屬于潛在基因毒性雜質(zhì)，需在產(chǎn)品中加以控制。按照毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)計(jì)算[13]，基因毒性雜質(zhì)的限度在1.5 μg/d，而艾司奧美拉唑鈉日劑量為40 mg，計(jì)算得GTI E和GTI I的限度應(yīng)為37.5 μg/g?，F(xiàn)有藥典[14-15]雖已有2種雜質(zhì)的液相色譜檢驗(yàn)方法，但僅將二者作為基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)和控制，尚無(wú)法滿足要求。已有報(bào)道采用超高效液相(UPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術(shù)對(duì)奧美拉唑、埃索美拉唑合成中的起始物料殘留引入的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[16-17]，但尚未見(jiàn)利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)艾司奧美拉唑鈉合成工藝中副反應(yīng)引入的潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E和GTI I進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控的報(bào)道。

四極桿-線性離子阱(QTRAP)質(zhì)譜是混合型串聯(lián)質(zhì)譜，既保留了四極桿傳統(tǒng)的定量功能，又可通過(guò)多級(jí)碎裂提供化合物結(jié)構(gòu)信息，具有高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥品檢測(cè)等領(lǐng)域[18-20]。本文基于此技術(shù)建立了艾司奧美拉唑鈉中潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E和GTI I殘留的檢測(cè)方法，并將其用于艾司奧美拉唑鈉原料及市售制劑檢測(cè)。該研究彌補(bǔ)了HPLC/UV檢測(cè)靈敏度低的不足，可用于艾司奧美拉唑鈉原料及成品制劑中GTI E和GTI I 2種潛在基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)測(cè)與控制。

表1 含N-氧化芳香環(huán)的基因毒警示結(jié)構(gòu)、艾司奧美拉唑鈉及其2種潛在基因毒性雜質(zhì)的化學(xué)名及結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical names,structurals of N-oxide aromatic compounds(genetic toxicity warning structure),esomeprazole sodium and two potential genotoxic impurities

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB Sciex QTRAP 4500 LC-MS/MS液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AB Sciex公司)；MS304S梅特勒-托利多分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

奧美拉唑氮氧物(GTI E)購(gòu)自LGC英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室(Lot#：57290，純度99.5%)；奧美拉唑氮氧磺酰物(GTI I)購(gòu)自濟(jì)南蔚然生物科技有限公司(Lot#：WR-2017-601，純度98.79%)；注射用艾司奧美拉唑鈉購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司(規(guī)格：40 mg，批號(hào)：PBTB)；艾司奧美拉唑鈉原料由河南中師醫(yī)藥科技股份有限公司提供(批號(hào)：17090801X、17090802X、17090803X)。乙腈(色譜純)購(gòu)自德國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液的配制

對(duì)照品溶液：分別精密稱取GTI E、GTI I對(duì)照品適量于容量瓶中，加30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈水溶液溶解并定容稀釋成37.5、37.5 μg/L的對(duì)照品溶液。精密稱取艾司奧美拉唑鈉對(duì)照品適量，加30%乙腈水溶解并定容稀釋制成1.0 g/L對(duì)照品溶液。

混合對(duì)照溶液：分別精密稱取GTI E、GTI I對(duì)照品適量于同一容量瓶中，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成質(zhì)量濃度均為37.5 μg/L的混合對(duì)照溶液(1)，平行2份；另取艾司奧美拉唑鈉、GTI E、GTI I對(duì)照品適量于同一容量瓶中，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成質(zhì)量濃度分別為1 g/L、37.5 μg/L、37.5 μg/L的混合對(duì)照溶液(2)。

供試品溶液：取艾司奧美拉唑鈉原料或市售注射用艾司奧美拉唑鈉適量，精密稱定，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成1.0 g/L供試品溶液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agela VenusiL MP-C18(2.1 mm×100 mm，3 μm)色譜柱，流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min，55%～70% B；3～4 min，70% B；4～6 min，70%～90% B；6.0～6.1 min，90%～55% B；6.1～8.0 min，55% B。流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，艾司奧美拉唑鈉為ESI正離子模式，GTI E和GTI I為ESI負(fù)離子模式。離子源溫度：450 ℃，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)。艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I的保留時(shí)間、定量/定性離子、碰撞能量及離子化模式見(jiàn)表2。

表2 艾司奧美拉唑鈉及2種潛在基因毒性雜質(zhì)的保留時(shí)間、母離子、定量/定性離子、碰撞能量和離子化模式Table 2 Retention times，precursor ions,quantitative/qualitative ions,collision energies,ionization modes of esomeprazole sodium and GTI E，GTI I

*quantitative ions

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

圖1 艾司奧美拉唑鈉(A)及GTI E(B)、GTI I(C)的全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Scan mass spectra of esomeprazole sodium(A)and GTI E(B),GTI I(C)

艾司奧美拉唑鈉在水溶液中對(duì)光、pH值、溫度等均不穩(wěn)定，易分解變色降解產(chǎn)生其它雜質(zhì)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。故要保證液相進(jìn)樣周期不能太長(zhǎng)并減少雜質(zhì)干擾。而各藥典中提到的液相色譜條件均需加入磷酸緩沖鹽體系，會(huì)對(duì)儀器造成污染。本文以乙腈-水為流動(dòng)相，并在滿足分析要求的基礎(chǔ)上采用梯度洗脫，盡可能縮短分析時(shí)間，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見(jiàn)“1.3”。所用外購(gòu)對(duì)照品均已進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，分別用對(duì)照品溶液在“1.3”色譜條件下測(cè)定艾司奧美拉唑鈉、GTI E、GTI I，三者的出峰時(shí)間分別3.00、3.63、4.45 min；GTI E、GTI I對(duì)應(yīng)的分子離子峰[M-1]-分別為m/z360.1和375.8(ESI-)，通過(guò)儀器軟件計(jì)算同位素位置和豐度比，得到2種離子元素組成，繼而得其分子式分別為C17H18N3O4S和C17H19N3O5S，與GTI E、GTI I分子式一致，全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

在“1.3”色譜條件下，依據(jù)藥典中提及的色譜柱型號(hào)選擇效能相近的Agela VenusiL MP-C18(2.1 mm×100 mm，3 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)、Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm) 3種色譜柱考察其分離情況。結(jié)果顯示，艾司奧美拉唑鈉主峰和GTI E、GTI I在3種色譜柱上均能實(shí)現(xiàn)良好分離，2種雜質(zhì)的峰形均較好。但此液相條件下艾司奧美拉唑鈉主峰在后2種色譜柱上峰形拖尾較明顯，需在水相中加入磷酸鹽緩沖體系才能改善。進(jìn)一步考察回收率時(shí)發(fā)現(xiàn)，GTI E、GTI I在后2種色譜柱上的回收率(<80%)低于Agela VenusiL MP-C18色譜柱，即使調(diào)節(jié)梯度洗脫濃度使主峰和GTI E、GTI I分離度增加后也無(wú)明顯改善，其原因一方面可能是艾司奧美拉唑鈉高濃度的主峰對(duì)GTI E、GTI I有離子抑制效應(yīng)，另一方面可能源于Agela Venusil MP-C18色譜柱采用了雙層表面處理技術(shù)，硅膠表面的羥基數(shù)量、親水性、硅膠表面純度均增加，但該技術(shù)處理的硅羥基酸性減弱(雙層表面處理技術(shù)處理的硅羥基pH值約5.2，普通硅羥基pH值約3.5)，硅羥基的活性比普通硅膠柱弱，抑制了二次保留效應(yīng)，從而減弱了非特異性吸附，因在此液相條件下性能優(yōu)于后2種色譜柱。故本文采用Agela VenusiL MP-C18色譜柱同時(shí)檢測(cè)艾司奧美拉唑鈉中GTI E、GTI I的殘留。此條件下，艾司奧美拉唑鈉主峰、GTI E、GTI I能夠很好地分離，回收率均在85%以上。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧離子源，分別在正、負(fù)離子模式下，對(duì)艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I對(duì)照溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子峰分別為[M+1]+(m/z368)和[M-1]-(m/z360.1和375.8)。再分別對(duì)分子離子峰進(jìn)行子離子掃描，得到二級(jí)質(zhì)譜，選擇響應(yīng)值最高的子離子作為定量離子，另一個(gè)作為定性離子。采用MRM模式，優(yōu)化母離子和兩個(gè)碎片離子的最佳碰撞能量，最佳質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)在優(yōu)化色譜條件下，取30%乙腈水溶液作為空白溶劑進(jìn)樣。分別取“1.2”制備的37.5 μg/L的GTI E、GTI I對(duì)照品溶液，艾司奧美拉唑鈉對(duì)照品溶液用30%乙腈水溶液稀釋制成1 μg/L溶液進(jìn)樣。取“1.2”制備的混合對(duì)照溶液(2)作為系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5針。結(jié)果表明，空白溶劑無(wú)干擾，GTI E、GTI I、艾司奧美拉唑鈉出峰時(shí)間分別3.00、3.63、4.45 min。連續(xù)5針系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)峰峰面積的RSD均小于8.0%，保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，表明該系統(tǒng)穩(wěn)定，方法滿足要求，溶劑空白、艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量下限及回收率在優(yōu)化色譜條件下，精密稱定GTI E、GTI I適量，分別以30%乙腈水溶液稀釋配制成GTI E質(zhì)量濃度為1.26、17.9、29.1、38.1、44.8 μg/L，GTI I質(zhì)量濃度為1.34、22.6、29.4、38.4、45.2 μg/L的溶液進(jìn)樣，以各化合物的定量離子色譜峰面積對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，GTI E和GTI I分別在1.26～44.8、1.34～45.2 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.994 7和0.992 8，線性方程分別為y=5.0×106x-1 633.5和y=3.0×106x+1 648.6。分別以其3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ),得GTI E、GTI I的LOD分別為0.381、0.384 μg/L，LOQ分別為1.26、1.34 μg/L。方法的靈敏度完全滿足依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則計(jì)算的37.5 μg/g的雜質(zhì)限度。以不含GTI E、GTI I的艾司奧美拉唑鈉為空白基質(zhì)，添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的GTI E、GTI I進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定3份，得GTI E、GTI I平均回收率分別為86.3%～87.6%和85.8%～91.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)分別為1.5%～2.2%和0.7%～4.0%，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 溶劑空白(A)、艾司奧美拉唑鈉(B)、GTI E(C)及GTI I(D)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank(A),esomeprazole sodium(B),GTI E(C) and GTI I(D)

表3 艾司奧美拉唑鈉中添加GTI E、GTI I的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of GTI E and GTI I in esomeprazole sodium

2.3.3 穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)在優(yōu)化條件下，照“1.2”方法配制兩份混合對(duì)照溶液(1)，分別于室溫及冷藏條件下(4 ℃)在0、1、2、3、4、5、6 h進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，室溫和冷藏條件下6 h內(nèi)GTI E、GTI I峰面積的RSD均小于10%，表明其在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。對(duì)100%限度濃度的GTI E、GTI I連續(xù)測(cè)定6次，得峰面積的RSD分別為1.7%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 實(shí)際應(yīng)用

在優(yōu)化條件下，按“1.2”方法配制各供試品溶液，對(duì)艾司奧美拉唑鈉3批原料及市售阿斯利康制劑注射用艾司奧美拉唑鈉中的GTI E、GTI I進(jìn)行檢測(cè)(表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批原料及阿斯利康制劑中均檢出GTI E、GTI I，市售阿斯利康制劑中GTI I含量大于3批原料，而3批原料中的GTI E檢出量大于阿斯利康制劑，但兩者檢出的2種潛在基因毒性雜質(zhì)含量均遠(yuǎn)低于基因毒性雜質(zhì)限度(37.5 μg/g)。

表4 艾司奧美拉唑原料及注射用艾斯奧美拉唑鈉樣品中2種潛在基因毒雜質(zhì)含量Table 4 Contents of GTI E，GTI I in the esomeprazole sodium and esomeprazole sodium for injection

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-QTARAP-MS/MS)測(cè)定艾司奧美拉唑鈉藥物中GTI E、GTI I 2種潛在基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的分析方法。該方法靈敏度高、分離度好，回收率、精密度及定量下限等均能滿足基因毒性雜質(zhì)限度的要求，是檢測(cè)艾司奧美拉唑鈉藥品中2種基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的有效方法。將所建方法應(yīng)用于艾司奧美拉唑鈉原料藥和市售阿斯利康注射用艾司奧美拉唑鈉制劑樣品檢測(cè)，樣品均檢出痕量的潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E、GTI I，但均遠(yuǎn)低于根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)計(jì)算出的37.5 μg/g限度。隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)逐步健全，藥政官方對(duì)基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管要求越來(lái)越高，因基因毒性雜質(zhì)控制不合規(guī)而導(dǎo)致的評(píng)審發(fā)補(bǔ)和退審、產(chǎn)品召回等事件越來(lái)越多，充分的基因毒性雜質(zhì)研究已經(jīng)成為產(chǎn)品能否上市的關(guān)鍵。本方法可為艾司奧美拉唑鈉原料及制劑生產(chǎn)企業(yè)2種潛在基因毒性雜質(zhì)控制提供依據(jù)和參考。