曾廣豐，謝建軍*，王志元，陳 峰，李 菊

(1.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室 ，廣東 廣州 510623)

涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的水土和氣象等特性，在預(yù)防疾病與保健養(yǎng)生的過程中，用獨特的研制方法將天然中草藥熬制成一種具有清熱解毒、利津祛火、防治常病等功能的植物性飲料[1-2]。自2006年廣東涼茶成功列入首批國家級非物質(zhì)文化保護遺產(chǎn)以來，涼茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，市場競爭激烈。一些不法商家受利益驅(qū)使，為增強療效，搶占市場，在自制涼茶中非法添加解熱鎮(zhèn)痛和止咳西藥。消費者飲用此類涼茶可能會產(chǎn)生嚴重肝腎毒性。

目前涼茶中違禁化學(xué)藥物的檢測方法主要包括薄層色譜法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]等。上述涼茶中非法添加成分的分析方法是針對已知目標(biāo)成分的分析，需有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。色譜類設(shè)備和基于四極桿型質(zhì)量分析器的質(zhì)譜由于靈敏度和分辨率低，只能用于數(shù)量不多的已知目標(biāo)物檢測[9-11]。如果需要對非靶向目標(biāo)物進行定性檢測，則需要借助分辨率更高的質(zhì)譜分析技術(shù)[12-14]。四極桿-飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF/MS)是一種可以快速區(qū)分和鑒定涼茶中非法添加物的有效方法，在一級質(zhì)譜中可確定目標(biāo)物分子量，再通過二級質(zhì)譜得到各化合物的不同碎片信息，結(jié)合HPLC 中的保留時間信息,并與文獻或標(biāo)準(zhǔn)品對照從而確定化合物的結(jié)構(gòu)[15-16]。本文以涼茶作為研究基質(zhì)，結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù)，采用HPLC-Q-TOF/MS對涼茶中的非法添加物進行無標(biāo)準(zhǔn)品非靶向快速定性篩查。該方法分析速度快、通量高，可為涼茶中非法添加物的快速篩查和質(zhì)量控制提供重要的方法依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 藥品及試劑

對乙酰氨基酚、鹽酸苯海拉明、雙氯芬酸鈉、馬來酸氯苯那敏(純度大于99.0%，德國Dr.Ehrestorfor，購自安譜公司)；罌粟堿、那可丁、可待因、蒂巴因、可待因-D3(純度大于99.0%，CNW，購自安譜公司)；乙腈、甲酸(HPLC級，美國Thermo Fisher公司)；氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、無水硫酸鎂、中性氧化鋁(Al-N)、氨丙基粉(NH2)、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)、硅膠粉、堿性氧化鋁(Al-B)、硅膠鍵合十八烷基(C18)均購自安譜公司。實驗用水為Milli-Q 超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)(法國Merck Millipore公司)。

1.3 樣品收集與前處理

涼茶樣品分別購于散裝涼茶零售店，包括口腔茶、咽喉茶、感冒茶、止咳茶、清熱降火茶等。

準(zhǔn)確稱取5 g涼茶樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL 0.5%乙酸乙腈，渦旋振蕩1 min后加入4.0 g MgSO4、0.5 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和1.0 g NaCl，渦旋振蕩提取5 min，于10 000 r/min離心5 min，吸收上清液1 mL于裝有75 mg氨丙基粉的2 mL離心管中渦旋振蕩1 min，于12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供HPLC-Q-TOF/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為0.1%(體積分數(shù))甲酸，B為乙腈，梯度洗脫：0～10 min，5%～90%B；10～13 min，90%～100%B；13～16 min，100%B；16～17 min，100%～5%B；17～20 min，5%B；流速：0.5 mL/min；進樣量5 μL；柱溫：40℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI和APCI復(fù)合源；APCI源連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS)，每10個樣品自動校正1次，校正液流速0.35 mL/min；一級TOF/MS掃描精確質(zhì)量范圍：100～1 000 Da；數(shù)據(jù)采集時間：100 ms；二級IDA-MS掃描精確質(zhì)量范圍：50～1 000 Da；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時間：50 ms；信號閾值：100 cps； IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。源內(nèi)參數(shù)見表1。

表1 TOF-IDA-MS模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of TOF-IDA-MS

1.5 篩查方法

樣液的高分辨質(zhì)譜信息由ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，并采用PeakView 2.0軟件對實際樣品中的非法添加物進行篩查。通過查閱文獻，得到常見的解熱鎮(zhèn)痛和止咳西藥的化合物列表，并導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件中。然后設(shè)置相應(yīng)的檢索參數(shù)：精確質(zhì)量偏差范圍為±1×10-5，保留時間限定范圍為±0.2 min，離子化模式設(shè)定為+H模式。用軟件計算化合物的實測值與理論值的偏差，通過分子離子的精確質(zhì)量偏差、同位素分布、同位素比例及保留時間進行綜合分析，并給出相應(yīng)的檢索匹配得分值，對于檢索結(jié)果中精確質(zhì)量數(shù)、同位素比值和二級碎片匹配得分值大于80的化合物，本方法確認其為檢出非法添加物。

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶向快速篩查非法添加物的質(zhì)控方法

為確保篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實驗挑選 8種非法添加物進行質(zhì)控實驗。選擇的非法添加物包括解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳平喘類西藥:對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、鹽酸苯海拉明、蒂巴因、罌栗堿、那可丁、可待因。選擇的8種質(zhì)控化合物極性跨度大、出峰時間分散，離子化模式同時包括正負離子模型，能夠有效監(jiān)控非靶向篩查過程中整體實驗條件的穩(wěn)定性，確保篩查結(jié)果穩(wěn)定可靠。8種質(zhì)控化合物分別在“1.5”條件下進行實驗，優(yōu)化前處理和儀器檢測條件。

2.1.1 質(zhì)譜檢測模式選擇由于對乙酰氨基酚、鹽酸苯海拉明、馬來酸氯苯那敏、可待因、罌粟堿、蒂巴因和那可丁在ESI+模式下分子離子峰具有更高的響應(yīng)，信號更穩(wěn)定，故選擇正離子模式檢測，其分子離子峰為[M+H]+；雙氯芬酸鈉的分子結(jié)構(gòu)中含有Na+，在ESI-模式下可獲得較高響應(yīng)，故選擇負離子模式檢測，其分子離子峰為[M-Na]-。Triple TOF 5600型系統(tǒng)中配置的復(fù)合離子源有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)電離源兩種，本研究選擇電噴霧離子源作為檢測離子源，大氣壓化學(xué)電離源作為校正離子源。

2.1.2 吸附劑的種類與用量考察了Al-N、NH2、GCB、PSA、Si和C18吸附劑的凈化效果及吸附劑的最佳用量，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)各吸附劑用量均為100 mg時，NH2粉對8種目標(biāo)化合物的吸附最小，回收率為86.8%～100%；而其它吸附劑對目標(biāo)化合物的影響較大，個別化合物的回收率低于65%。同時，考察了不同用量的NH2粉對8種質(zhì)控化合物吸附情況的影響。當(dāng)NH2粉的用量為75 mg時，8種目標(biāo)化合物的吸附最小，回收率為89.8%～100%；隨著NH2粉用量的增加，雙氯芬酸鈉的回收率逐漸降低，當(dāng)NH2粉用量為175 mg時，回收率只有44.2%。因此，最終選用NH2粉作為吸附劑，其最佳用量為75 mg，此時可獲得較好的凈化效果。

圖1 不同吸附劑對8種質(zhì)控化合物回收率的影響Fig.1 Effects of different sorbents on recoveries of 8 compoundsA:paracetamol,B:diphenhydramine,C:chlorphenamine maleate,D:diclofenac sodium,E:codeine,F:thebaine,G:noscapine,H:papaverine

2.1.3 質(zhì)控化合物的定性定量依據(jù)本研究選擇8種非法添加物作為目標(biāo)分析對照物質(zhì)，對8個目標(biāo)化合物進行HPLC-Q-TOF/MS分析，以獲得目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息；根據(jù)一級TOF/MS和二級IDA-MS質(zhì)譜信息定性定量分析目標(biāo)化合物。8個目標(biāo)化合物的定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2。

表2 8種非法添加物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Mass fragmentations of 8 compounds analyzed by IDA-MS

圖2 8種質(zhì)控化合物的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 8 compounds

2.1.4 質(zhì)控非法添加物定量曲線的建立樣品中8種非法添加物的含量，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級TOF/MS高分辨質(zhì)譜信息進行分析?？纱蛴脙?nèi)標(biāo)法定量，其它化合物用外標(biāo)法定量。首先利用HPLC-Q-TOF/MS獲得目標(biāo)化合物的離子流色譜圖，8種目標(biāo)化合物配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成系列不同質(zhì)量濃度，檢測后獲得目標(biāo)化合物的校正曲線以及線性范圍(見表3)；同時以3 倍信噪比和10 倍信噪比為依據(jù)，確定方法的檢出限與定量下限。8 種目標(biāo)化合物的高分辨提取離子流圖見圖2。結(jié)果表明，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.999 0，檢出限為2.0～10 μg/kg，定量下限為5.0～25 μg/kg，相關(guān)參數(shù)見表3。由質(zhì)控非法添加物的定量分析結(jié)果可知，本方法的檢出限低、靈敏度高，可用于非靶向非法添加物的快速篩查。

表3 8種化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限與定量下限Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 8 compounds compounds

2.1.5 質(zhì)控化合物的精密度對檢測為陰性的感冒茶基質(zhì)進行加標(biāo)回收實驗。添加3個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實驗方法進行測定，每個濃度水平做6份平行樣品，其平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表4。由表4可知，樣品的平均回收率為75.8%～95.6%,RSD為2.1%～6.5%，方法的精密度及準(zhǔn)確度良好，可用于非靶向非法添加物殘留的快速篩查。

表4 8種質(zhì)控化合物的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviations of 8 compounds(n=6)

2.2 非靶向非法添加物殘留的快速篩查流程

基于“2.1”的優(yōu)化結(jié)果可知，本方法的篩查技術(shù)穩(wěn)定性好、靈敏度高，可擴展到解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳類西藥的非靶向篩查。自建高分辨數(shù)據(jù)庫是實現(xiàn)非靶向篩查的基礎(chǔ)，PeakView 2.0軟件是進行化合物信息數(shù)據(jù)存儲以及歸類的專業(yè)軟件。將關(guān)注的解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳類西藥的分子式導(dǎo)入PeakView 2.0構(gòu)成篩查數(shù)據(jù)庫。樣品經(jīng)前處理后供HPLC-Q-TOF/MS測定。采集的一級質(zhì)譜圖包含化合物的精確質(zhì)量數(shù)和分子式。使用一級譜圖對篩查出的可疑非法添加物進行一級同位素分布和母離子精確質(zhì)量數(shù)匹配分析。如果一級譜圖信息匹配，再對二級碎片豐度比和精確質(zhì)量數(shù)等信息進行匹配。通過ChemDraw Ultra 12.0軟件繪制可疑成分的結(jié)構(gòu)式，并將其導(dǎo)入PeakView 2.0軟件，將結(jié)構(gòu)與二級碎片進行匹配，并結(jié)合相應(yīng)的檢索匹配得分值判斷目標(biāo)化合物是否檢出。以對乙酰氨基酚篩查為例，建立非靶向篩查非法添加西藥的分析方法，篩查流程圖見圖3：將對乙酰氨基酚分子式導(dǎo)入PeakView 2.0中，并定義離子化模式為[M+H]+，得到的一級高分辨精確質(zhì)量數(shù)和同位素比例見圖3A。調(diào)用其二級質(zhì)譜圖，結(jié)合其結(jié)構(gòu)式進行結(jié)構(gòu)與二級精確質(zhì)量數(shù)的匹配。匹配結(jié)果見圖3B，對乙酰氨基酚的3個主要碎片均與結(jié)構(gòu)完全匹配，3個碎片的精確質(zhì)量數(shù)誤差小于0.001 Da，因此可判定為檢出。本文所建立涼茶中的非法添加物非靶向篩查技術(shù)完全滿足方法學(xué)要求。

圖3 對乙酰氨基酚的定性篩查圖示Fig.3 Qualitative screening flow chart of paracetamol

2.3 實際樣品的篩查

采取建立的篩查方法對市售的50份散裝涼茶樣品進行測定。首先使用“1.5”所建立的方法對樣品進行篩查，如定性檢出非法添加物，再進行定量分析。檢測結(jié)果表明，共有10份涼茶樣品檢出對乙酰氨基酚，其中3份口腔茶的檢出量分別為21.5、4.43、6.11 mg/kg；2份咽喉茶的檢出量分別為5.38、4.14 mg/kg；1份感冒茶的檢出量為5.66 mg/kg；1份止咳茶的檢出量為4.59 mg/kg；1份潤肺止咳茶的檢出量為26.7 mg/kg； 2份特效感冒茶的檢出量分別為2 188、1 519 mg/kg。

3 結(jié) 論

本文利用QuEChERS/HPLC-Q-TOF/MS建立了涼茶中非法添加物的非靶向篩查方法。通過添加 8種化合物作為質(zhì)控化合物，優(yōu)化了QuEChERS方法對涼茶樣品的前處理條件。采用軟件對數(shù)據(jù)進行處理，無需對照標(biāo)準(zhǔn)品，通過對目標(biāo)化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素比例等信息進行比對，并結(jié)合二級碎片譜圖與結(jié)構(gòu)匹配技術(shù)即可同時篩查和確認涼茶中的多種非法添加物殘留。本方法的建立可為涼茶中非法添加西藥的快速篩查和質(zhì)量控制提供技術(shù)依據(jù)。