金軼平，朱皓皓

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是成年人失明的首要原因[1]。目前，治療DR的方法主要有激光光凝、玻璃體切割手術(shù)以及抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)藥物或糖皮質(zhì)激素等藥物的運(yùn)用，但這些方法并不能完全阻止DR的發(fā)展，因此更多有效的治療方法有待發(fā)現(xiàn)和研究[2]。Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜中數(shù)量最多的細(xì)胞，位于視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管之間，為視網(wǎng)膜提供結(jié)構(gòu)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持，具有調(diào)節(jié)突觸發(fā)育、神經(jīng)血管耦合、電解質(zhì)平衡和細(xì)胞代謝等多種生理功能，在維持視網(wǎng)膜組織的健康和結(jié)構(gòu)完整性方面具有至關(guān)重要的作用[3-4]。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)在視網(wǎng)膜中只存在于Müller細(xì)胞中，為Müller細(xì)胞特異性標(biāo)記。黃連素作為我國(guó)應(yīng)用已久的傳統(tǒng)中藥，可從黃連等多種植物中提取，亦可人工合成，對(duì)于糖尿病腎病、糖尿病性神經(jīng)病、心腦血管疾病等多種糖尿病并發(fā)癥均有明確的抑制和改善作用[5-8]。本研究以25mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基模擬高糖狀態(tài)，用不同濃度黃連素作用于大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，研究黃連素對(duì)高糖培養(yǎng)下Müller細(xì)胞增殖的影響，探討黃連素在DR治療中的可能作用。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞形態(tài)觀察(×100) A：原代培養(yǎng)3d，視網(wǎng)膜組織塊周?chē)粩嘤幸暰W(wǎng)膜細(xì)胞爬出，貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，突起可有多條；B：原代培養(yǎng)10d，細(xì)胞融合。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生4～7d的Sprague Dawley(SD)大鼠(雌雄不限，SPF級(jí))購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。主要試劑：黃連素[美國(guó) Sigma公司，14050，≥90%(AT)，分子量371.81，C20H18ClNO4·xH2O]，DMSO(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，RPMI-1640(美國(guó)Hyclon公司)，青鏈霉素混合液(100×)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國(guó)Solarbio公司)，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)SAB公司)，兔抗鼠GS抗體(美國(guó)Abcam公司，Ab49873)，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0562)、DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。主要儀器設(shè)備：酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代出生4～7d的SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后取出眼球，在碘伏及含100U/mL青鏈霉素混合液的D-Hank液中各浸泡10min，D-Hank液沖洗，去除眼球外筋膜組織，沿角膜緣后1mm剪開(kāi)眼球壁，去除眼前節(jié)及玻璃體，分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜剪成小碎片，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化20min，吸管吹打，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，銅網(wǎng)過(guò)濾，將過(guò)濾液離心，棄上清液，沉淀物加細(xì)胞培養(yǎng)液吹打稀釋?zhuān)臃N于塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3d換液1次，去除懸浮細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁達(dá)到80%融合后按1∶2傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為傳至2代細(xì)胞。

1.2.2大鼠Müller細(xì)胞的鑒定取第2代細(xì)胞接種于放置經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片的六孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，用PBS液清洗，4%多聚甲醛固定10min，PBS液清洗，0.5% Triton穿孔15min，PBS液清洗，5%山羊血清封閉30min，加GS一抗(1∶200)，4℃過(guò)夜，PBS液漂洗，加山羊抗兔FITC二抗(1∶500)37℃雜交1h，PBS液漂洗，加DAPI染核，PBS液漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Müller細(xì)胞分組預(yù)先將黃連素溶解于50mmol/L DMSO溶液中，調(diào)整各組中黃連素濃度，同時(shí)保證各組中DMSO濃度≤0.05%。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分為正常糖濃度(5mmol/L)組、高糖濃度(25mmol/L)組、高糖+5μmol/L黃連素組、高糖+10μmol/L黃連素組、高糖+25μmol/L黃連素組、高糖+50μmol/L黃連素組和高糖+100μmol/L黃連素組。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)Müller細(xì)胞增殖活性對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，在顯微鏡下計(jì)數(shù)后制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72h后，按1∶10體積比混合CCK-8溶液和無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔100μL加入待測(cè)孔中，培養(yǎng)箱中孵育1h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值并記錄。

2結(jié)果

2.1大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞形態(tài)觀察大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代培養(yǎng)24h后，部分視網(wǎng)膜細(xì)胞貼壁；2～3d后視網(wǎng)膜組織塊周?chē)粩嘤幸暰W(wǎng)膜細(xì)胞爬出，首次換液去除未貼壁細(xì)胞及懸浮組織，貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，突起可有多條；7～10d原代細(xì)胞不斷增生融合，生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞開(kāi)始老化，此時(shí)予以傳代，傳代后第2、3代細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞形態(tài)較一致，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，可有數(shù)條突起，傳至第4代后細(xì)胞老化明顯，呈成纖維細(xì)胞樣改變(圖1)。

2.2大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的鑒定本研究培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)90%以上，幾乎所有細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)均表達(dá)GS，細(xì)胞核周?chē)植靠梢?jiàn)點(diǎn)狀高熒光聚集；DAPI染色顯示Müller細(xì)胞核完整，呈藍(lán)色熒光(圖2)。

2.3黃連素對(duì)高糖培養(yǎng)下Müller細(xì)胞增殖的影響CCK-8

表1 不同濃度黃連素處理不同時(shí)間對(duì)大鼠Müller細(xì)胞增殖的影響

注：aP<0.05，bP<0.01vs同一時(shí)間正常糖濃度組；cP<0.05，dP<0.01vs同一時(shí)間高糖濃度組；eP<0.05，fP<0.01vs同一時(shí)間高糖+5μmol/L黃連素組；gP<0.05，hP<0.01vs同一時(shí)間高糖+10μmol/L黃連素組。

檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，正常糖濃度組、高糖濃度組、高糖+5μmol/L黃連素組、高糖+10μmol/L黃連素組、高糖+25μmol/L黃連素組、高糖+50μmol/L黃連素組和高糖+100μmol/L黃連素組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72h吸光度值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常糖濃度組相比，高糖濃度組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72h吸光度值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與高糖濃度組相比，培養(yǎng)24h時(shí)，10、25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48h時(shí)，5μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值無(wú)明顯變化，10、25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值均明顯上升，且25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值組間均無(wú)明顯差異，但均高于5μmol/L黃連素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)72h時(shí)，5μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值仍無(wú)明顯變化，10、25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值均明顯上升，且均高于5μmol/L黃連素組，而25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值組間無(wú)明顯差異，但均高于10μmol/L黃連素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明黃連素能促進(jìn)高糖條件下Müller細(xì)胞的增殖活性。

2.4黃連素濃度與高糖培養(yǎng)下Müller細(xì)胞增殖的關(guān)系不同濃度黃連素組細(xì)胞培養(yǎng)72h的吸光度值與黃連素濃度呈正相關(guān)(r=0.7890，P<0.001)，見(jiàn)圖3，表明高糖環(huán)境下，隨著黃連素濃度的增加，Müller細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞活性降低的效應(yīng)逐漸減弱。

3討論

圖2 大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的鑒定(×200) 綠色表示大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS陽(yáng)性表達(dá)；藍(lán)色表示細(xì)胞核DAPI染色結(jié)果。

Müller細(xì)胞在高糖環(huán)境下尤其容易受到損傷，被認(rèn)為是DR發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[9]。大量研究證實(shí)，體外高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)Müller細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞增殖活性減弱[10-12]。本研究采用25mmol/L濃度的葡萄糖培養(yǎng)基模擬糖尿病患者體內(nèi)的高糖狀態(tài)，培養(yǎng)SD大鼠Müller細(xì)胞后，利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。CCK-8試劑中含有WST-8，其在電子載體(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚的量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖濃度組Müller細(xì)胞吸光度值顯著低于正常糖濃度組，提示高糖可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低，而25、50、100μmol/L黃連素組細(xì)胞吸光度值組間無(wú)明顯差異，表明上述三組細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯差別，25μmol/L濃度的黃連素即可減輕高糖對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3 黃連素濃度與高糖培養(yǎng)下Müller細(xì)胞吸光度值的關(guān)系。

黃連素藥源廣泛，價(jià)格低廉，具有降脂、降血糖、抗氧化、抗炎等多重作用[13-16]。研究表明，黃連素可以減輕由高糖、高脂誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率[16]，還可顯著抑制由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠胰島細(xì)胞死亡[17]。高度氧化糖化的低密度脂蛋白(HOG-LDL)可顯著降低人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的活性，而黃連素可有效抑制HOG-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[18]。但黃連素對(duì)單一高糖作用下Müller細(xì)胞的作用效果及與其濃度的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。本研究所采用的黃連素需溶解于DMSO溶液中，而DMSO具有一定的細(xì)胞毒性，含濃度為0.2% DMSO的培養(yǎng)液會(huì)抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)的增殖，而含濃度為0.05% DMSO的培養(yǎng)液則對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響[19]。為排除DMSO的干擾，本研究不同濃度黃連素組中的DMSO濃度≤0.05%，在高糖培養(yǎng)基中同時(shí)加入不同濃度(5、10、25、50、100μmol/L)黃連素培養(yǎng)Müller細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，10μmol/L濃度黃連素即可有效抑制由高糖導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低，且隨著黃連素濃度的增加，作用效果逐漸加強(qiáng)，這與既往研究表明0～20μmol/L黃連素能夠抑制細(xì)胞凋亡，且具有明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性[18-19]的結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激是糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的共同致病機(jī)制。體外高糖環(huán)境可使Müller細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低細(xì)胞活性。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)可結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)蛋白的表達(dá)，在Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用[20]。Nrf2激活劑dh404不僅能減少氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變中Müller細(xì)胞的膠質(zhì)增生，同時(shí)通過(guò)增加Nrf2反應(yīng)性抗氧化物減少缺氧誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中活性氧(ROS)及血管生成因子的升高[21]。Nrf2激活劑RS9能減輕光誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞死亡[22]。另有研究表明，黃連素能顯著降低糖尿病腎損傷大鼠的血糖水平和ROS、Kelch樣環(huán)氧丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)、還原型輔酶Ⅱ氧化酶4(NOX4)的水平，增強(qiáng)血清超氧化物歧化酶(SOD)活性以及Nrf2水平[23-24]。因此，黃連素可能通過(guò)調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路緩解氧化應(yīng)激，改善小鼠糖尿病腎病。黃連素還可明顯促進(jìn)抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2的表達(dá)，抑制Keap1的表達(dá)，從而抑制由缺氧再?gòu)?fù)氧造成的心肌細(xì)胞活力降低和凋亡增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能有效抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低，分析可能是通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路，緩解高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，高糖會(huì)抑制Müller細(xì)胞增殖活性，而經(jīng)黃連素處理后可有效抑制由高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低，且作用效果與黃連素濃度呈正相關(guān)，為黃連素應(yīng)用于治療DR提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究后續(xù)將對(duì)黃連素0～50μmol/L濃度梯度內(nèi)，高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡、炎癥因子的變化、氧化應(yīng)激反應(yīng)及其相關(guān)作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)做進(jìn)一步探索。