陳小霞，曹 陽

0引言

濾過手術(shù)是目前治療原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)的經(jīng)典手術(shù)方式，濾過泡瘢痕化是抗青光眼濾過術(shù)失敗的主要原因，主要是由于Tenon囊成纖維細(xì)胞(Tenon’s capsule fibroblasts, Tfb)在多種生長(zhǎng)因子(如TGF-β家族)的作用下增殖、移行和發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其特征性變化是胞漿內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)大量增加，細(xì)胞外基質(zhì)過度合成蓄積，最終導(dǎo)致濾過區(qū)瘢痕化[1-3]。Esson等[4]研究發(fā)現(xiàn)兔抗青光眼濾過術(shù)后結(jié)膜濾過泡組織中存在TGF-β2和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)的高表達(dá)，提示在濾過泡瘢痕形成過程中CTGF 可能起作用。因此，我們通過體外實(shí)驗(yàn)研究CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞增殖、移行和轉(zhuǎn)化的影響，以進(jìn)一步探討CTGF在濾過泡瘢痕化中的可能作用。

1材料和方法

1.1材料POAG患者Tenon囊組織:經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，和擬在本院眼科接受小梁切除術(shù)的POAG患者同意，其Tenon囊組織取自小梁切除術(shù)中。 主要試劑: DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(fetalbovine serum, FBS) (中國杭州四季青生物工程材料研究所)；0.25%胰蛋白酶(美國Ameresco公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(美國Invitrogen公司)；α-SMA及β-actin引物(中國武漢眾一生物技術(shù)有限公司合成)；噻唑藍(lán)(3, 4, 5-dimethyliazol-2, 5diphenyltetrazolium bromide, MTT)(美國Sigma公司)；小鼠抗人α-SMA多克隆抗體、免疫組化(SABC法)即用型試劑盒(山羊IgG)和DAB試劑盒(武漢意德生物技術(shù)有限公司)；人重組CTGF蛋白(美國Peprotech公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)利用POAG患者的Tenon囊組織行組織塊法培養(yǎng)Tfb細(xì)胞，接種后約1～2d，細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，繁殖較快，呈放射狀或旋渦狀走行。光鏡下檢查呈典型的梭形，胞體狹長(zhǎng)(圖1)。經(jīng)免疫組化染色，α-SMA陽性成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色染色(圖2)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，實(shí)驗(yàn)使用3～6代細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至5×104/mL，接種于96孔板中，每孔200μL。在5%CO2培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)24h后，換用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。實(shí)驗(yàn)分為兩組：(1)對(duì)照組：加入含0.5%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液；(2)CTGF處理組：加入終濃度為1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF的培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，作用48h后，每孔加入5g/L的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL的二甲基亞砜，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490nm吸光度(A)值。

圖1 正常Tfb細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)呈梭形(×100)。

圖2 α-SMA陽性成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色染色(×400)。

1.2.3細(xì)胞劃痕法檢測(cè)CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞移行的影響細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和同步化同前，用無菌的1 000μL的Tip頭造成條形細(xì)胞缺損區(qū)，PBS漂洗3次以去除懸浮細(xì)胞，細(xì)胞處理同前，繼續(xù)培養(yǎng)24h，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞移行情況，隨機(jī)選取每孔5個(gè)視野(100倍)并照相計(jì)數(shù)越過劃線移行的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞中α-SMA mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞處理同前，24h后收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于無RNase的水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值在1.8～2.0之間。α-SMA引物上游5’-ACTACTGCTGAGCGTGAGATTG-3’，下游5’-CATGATGCTGTTGTAGGTGGTT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為246bp；β-actin上游5’-AACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCA-3’，下游5’-CCACTCCCAGGGAGACCAAAAGCCT-3’，引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為380bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃30s，72℃60s，35次循環(huán)后，72℃延伸7min，取2.5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳40min，紫外燈下照相，用圖像分析處理系統(tǒng)(UVI公司)進(jìn)行灰度掃描。并以β-actin為內(nèi)參照，校正作相對(duì)量分析，數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)POAG患者Tfb細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的作用制備Tfb細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至5×105/mL，接種于放置消毒蓋玻片的12孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和同步化同前，細(xì)胞處理同前。24h后取出蓋玻片，新鮮配制的4%多聚甲醛固定15min，采用SABC試劑盒進(jìn)行α-SMA蛋白免疫組化染色，應(yīng)用德國DMR+Q550病理圖像免疫組化測(cè)量系統(tǒng)，對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野輸入計(jì)算機(jī)，測(cè)量陽性細(xì)胞的平均光密度值。

圖3 不同濃度CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞移行的影響(×100) A:對(duì)照組；B：1.0ng/mL CTGF組；C:10.0ng/mL CTGF組；D：100.0ng/mL CTGF組。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS15.0軟件包處理數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，首先采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，若存在差異，可進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞增殖的影響在實(shí)驗(yàn)條件下，MTT法測(cè)得1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF處理組的A值分別是0.436±0.009、0.643±0.009、0.679±0.006, 對(duì)照組為0.423±0.156。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.624,P=0.010)，1.0ng/mL CTGF組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.482,P=0.297)，10.0、100.0ng/mL CTGF組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.638,P=0.005；t=8.642,P=0.010),1.0ng/mL分別與10.0、100.0ng/mL CTGF組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.183,P=0.009；t=8.326,P=0.010),10.0ng/mL與100.0ng/mL CTGF組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.486,P=0.016)。

2.2不同濃度CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞移行的影響在劃線后24h, 可見對(duì)照組和處理組均有成纖維細(xì)胞向空白區(qū)移行生長(zhǎng),1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF處理組的細(xì)胞移行數(shù)分別為34.600±3.507、70.400±2.074、80.000±2.915個(gè)，對(duì)照組為31.000±3.536個(gè)。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.835,P=0.010)，1.0ng/mL CTGF組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.586,P=0.283)，10.0、100.0ng/mL CTGF組與對(duì)照組相比移行細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.132,P=0.005；t=8.649,P=0.010)。1.0ng/mL分別與10.0、100.0ng/mL CTGF組間相比移行細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.163,P=0.008；t=10.961,P=0.012)，10.0ng/mL與100.0ng/mL CTGF組間相比移行細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.364,P=0.010)。

圖4 POAG患者Tfb細(xì)胞α-SMA和β-actin RT-PR凝膠電泳結(jié)果 M:Marker；1：對(duì)照組；2：1.0ng/mL CTGF組；3：10.0ng/mL CTGF組；4：100.0ng/mL CTGF組。

2.3不同濃度CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果提示，細(xì)胞處理24h后，1.0、10.0、100.0ng/mL的濃度CTGF處理組α-SMA/β-actin條帶吸光度比值分別為0.873±0.161、1.213±0.312、1.352±0.376,對(duì)照組是0.851±0.158。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.423,P=0.002),1.0ng/mL CTGF處理組α-SMA/β-actin條帶吸光度比值與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.123,P=0.243)，10.0、100.0ng/mL CTGF處理組與對(duì)照組α-SMA/β-actin比值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.543,P=0.001；t=7.616,P=0.001)。1.0ng/mL分別與10.0、100.0ng/mL CTGF處理組α-SMA/β-actin比值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.165,P=0.003；t=8.642,P=0.010),10.0ng/mL與100.0ng/mL CTGF處理組α-SMA/β-actin比值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.165,P=0.001)。

2.4不同濃度CTGF對(duì)POAG患者Tfb細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響α-SMA陽性成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色染色，CTGF誘導(dǎo)Tfb細(xì)胞24h后，1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF處理組陽性細(xì)胞的平均光密度值分別是0.110±0.026、0.141±0.017、0.175±0.027，對(duì)照組是0.108±0.020。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.397,P=0.002)，1.0ng/mL CTGF組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.412,P=0.136)，10.0、100.0ng/mL CTGF實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞的平均光密度值與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.136,P=0.000；t=4.954,P=0.001)。1.0ng/mL分別與10.0、100.0ng/mL CTGF實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞的平均光密度值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.613,P=0.004；t=6.108,P=0.006),10.0ng/mL與100.0ng/mL CTGF實(shí)驗(yàn)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.489,P=0.005)。

3討論

POAG是我國主要致盲眼病之一，濾過手術(shù)是目前抗青光眼手術(shù)的主要方式。濾過泡瘢痕形成是抗青光眼濾過術(shù)失敗的主要原因，主要是由于Tfb在多種細(xì)胞因子(如TGF-β家族)的作用下增殖、移行和發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[1-3]，免疫組化研究顯示，肌成纖維細(xì)胞含有肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，尤其是高表達(dá)α-SMA，α-SMA是目前公認(rèn)的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物。肌成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和多種生物活性因子參與組織修復(fù)，若肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在則可形成組織纖維化，并發(fā)生瘢痕收縮，最終導(dǎo)致濾過區(qū)瘢痕化[5]。

眾所周知，TGF-β被認(rèn)為是促進(jìn)纖維化發(fā)展最重要的生長(zhǎng)因子，在青光眼濾過泡瘢痕化形成中亦起著重要作用。朱曉燕等[6]發(fā)現(xiàn)TGF-β可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化，一定程度上其作用呈質(zhì)量濃度依賴性和時(shí)間依賴性，且細(xì)胞收縮力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，可能是青光眼濾過術(shù)后濾過通道建立失敗的重要機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，TGF-β抗體(CAT-152)能夠提高青光眼術(shù)后功能濾過泡的形成率、延長(zhǎng)濾泡存在時(shí)間[7]。

圖5 不同濃度CTGF作用POAG患者Tfb中α-SMA染色情況(SABC×400) A:對(duì)照組；B：1.0ng/mL CTGF組；C:10.0ng/mL CTGF組；D：100.0ng/mL CTGF組。

TGF-β除了誘導(dǎo)如成纖維細(xì)胞等的間質(zhì)細(xì)胞增生與分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成、加快傷口愈合；還能夠抑制包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等的增殖與分化；抑制免疫反應(yīng)、防止腫瘤的發(fā)生和惡變。為了避免因抑制TGF-β可能引起的不良反應(yīng)，需要尋求特異性更強(qiáng)的抗纖維化性治療靶點(diǎn)。

CTGF是一種36～38kD的富含半胱氨酸的分泌型糖基化蛋白，由349個(gè)氨基酸組成。人的CTGF是1991年Bradham等[8]從培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，CTGF是高度保守的即刻早期基因CCN家族的成員之一，其生物學(xué)效應(yīng)包括刺激細(xì)胞增生、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的生成、新生血管形成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等[8-10]。作為TGF-β的下游信號(hào)分子，CTGF的作用比較單一，并且介導(dǎo)TGF-β的促纖維化作用時(shí)，作用范圍往往局限在結(jié)締組織的間質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)CTGF表達(dá)的靶向性阻斷可能會(huì)成為組織和器官抗纖維化治療的關(guān)鍵。

Hao等[11]采用CTGF siRNA 重組慢病毒抑制CTGF在肝星狀細(xì)胞和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)：可明顯地抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，降低細(xì)胞外基質(zhì)合成。而且CTGF shRNA重組體能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和黏附能力[12]。表明CTGF在肝纖維化發(fā)病中起關(guān)鍵作用，抑制CTGF可能是治療肝纖維化的有效方法。張樹華等[13]應(yīng)用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟CTGF含量，同時(shí)進(jìn)行腎臟病理檢測(cè)并進(jìn)行組間比較來探討糖尿病大鼠腎臟纖維化與CTGF表達(dá)的關(guān)系得出，糖尿病大鼠CTGF的高表達(dá)，可能與腎臟纖維化有關(guān)，檢測(cè)腎臟CTGF含量可考慮作為評(píng)價(jià)腎臟纖維化的方法。

在眼組織纖維化研究方面，CTGF被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)體外培養(yǎng)兔的角膜成纖維細(xì)胞增殖、向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和合成細(xì)胞外基質(zhì)[14]。也可以促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞α-SMA基因和蛋白的表達(dá)，并且隨濃度的增加作用增強(qiáng)?？纱龠M(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成[15]。CTGF也能夠促進(jìn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞增生，而CTGF RNAi不但能夠顯著抑制其增生，還可顯著抑制由劃痕實(shí)驗(yàn)引發(fā)的ARPE-19細(xì)胞的遷移。此外，CTGF可通過上調(diào)α-SMA表達(dá)水平而增強(qiáng)ARPE-19細(xì)胞對(duì)于TGF-β1的反應(yīng)，CTGF RNAi可使TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)減弱[16]。TGF-β能夠明顯地促進(jìn)Tfb細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其下游介質(zhì)CTGF的表達(dá)和合成細(xì)胞外基質(zhì)-纖維連接蛋白[17]。

我們以體外培養(yǎng)POAG患者的Tfb作為研究對(duì)象，觀察了CTGF對(duì)其增殖和表型轉(zhuǎn)化的影響，并首次報(bào)道了CTGF對(duì)Tfb移行的影響。結(jié)果顯示細(xì)胞作用24h后，1.0ng/mL CTGF對(duì)Tfb的增殖、移行無明顯作用，而10.0、100.0ng/mL CTGF能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、移行。細(xì)胞作用48h后，10.0、100.0ng/mL CTGF能夠上調(diào)α-SMA mRNA的水平，10.0、100.0ng/mL CTGF刺激后Tfb α-SMA蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性。本研究發(fā)現(xiàn)CTGF組能促進(jìn)POAG患者Tfb的增殖、移行，并促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，推測(cè)CTGF可能在濾過道和濾過泡的創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化過程中扮演重要作用。針對(duì)CTGF的靶向治療有可能開辟一條僅特異作用于TGF-β引起的纖維化作用，而不影響其它免疫活性作用發(fā)揮的新途徑，為青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成的防治提供新的方向。