賈路路，路頂立，劉素素，陳雨晴，李志杰,2，王麗婭

0引言

角膜創(chuàng)傷是眼科常見的急癥，角膜創(chuàng)傷的愈合是一個重要的臨床問題，快速良好的角膜創(chuàng)傷修復(fù)對于恢復(fù)角膜完整性和視力至關(guān)重要。角膜的創(chuàng)傷修復(fù)是一個動態(tài)、有序的過程，涉及到復(fù)雜的細(xì)胞和分子機(jī)制。這一過程中生長因子和細(xì)胞因子是重要的調(diào)節(jié)因子，可刺激參與傷口愈合的細(xì)胞生長、增殖、遷移、分化、黏附，以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積和蛋白酶調(diào)節(jié)等[1-2]。動物實(shí)驗研究顯示，在角膜創(chuàng)傷修復(fù)的初期，角膜上的免疫細(xì)胞通過角膜緣血管網(wǎng)向創(chuàng)傷區(qū)域遷移，通過釋放大量的生長因子、細(xì)胞因子和各種酶類等物質(zhì)促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。其中中性粒細(xì)胞和γδT細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用[3-5]。因此，任何破壞或者干擾炎癥細(xì)胞功能和免疫反應(yīng)過程的因素都會造成角膜創(chuàng)傷修復(fù)的延遲。

哺乳動物腸道存在著多樣復(fù)雜的共生微生物，其中包括細(xì)菌、古生菌、真菌、病毒等。人體腸道中約定植1012～1014個微生物，基因總量是人基因的150倍，被稱為人類的第二套基因組[6]。大量研究表明，腸道微生物參與人體的營養(yǎng)代謝、腸道功能、免疫調(diào)節(jié)等生理過程，腸道微生態(tài)的失調(diào)常伴隨多系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如心腦血管疾病、肥胖、糖尿病，甚至神經(jīng)組織的修復(fù)再生等[7-10]。這些研究主要闡明腸道細(xì)菌與疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，但在腸道真菌方面研究甚少。腸道真菌作為腸道微生態(tài)的重要一員，亦有著不可忽視的作用。長期口服抗真菌藥物兩性霉素B可造成腸道真菌菌群失調(diào)，增加炎癥性腸道疾病和過敏性呼吸道疾病的嚴(yán)重程度。并且兩性霉素B在腸道幾乎不可吸收，因此可以排除腸道外非特異效應(yīng)的作用[11-12]。本研究通過兩性霉素B誘導(dǎo)腸道真菌菌群失調(diào)，從而探索腸道真菌菌群失調(diào)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響，試圖從腸道真菌菌群方面為角膜創(chuàng)傷的治療提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，8～12周齡，體質(zhì)量23～25g，均購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，裂隙燈下檢查雙眼角膜均無病變。小鼠的飼養(yǎng)與使用均遵照視覺與眼科研究協(xié)會制定的科研動物使用規(guī)范，經(jīng)河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室管理與倫理審查委員會批準(zhǔn)。動物飼養(yǎng)環(huán)境為12h光照/12h黑暗(上午6∶00開燈，下午6∶00關(guān)燈)的循環(huán)周期。

1.1.2主要實(shí)驗試劑免疫熒光試劑FITC/Gr-1(553127，BD Bioscience)；PE/GL3(553178，BD Bioscience)；4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(944021，美國Invitrogen公司)；Bovine Serum Albumin(9048-46-8，BIOSHARP)；Triton X-100(T8200，北京索萊寶科技有限公司)；封片膠(F4680-25ML，美國Sigma公司)；多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；熒光素鈉(H11619-1009，美國Alcon公司)；兩性霉素B(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；糞便樣本DNA提取試劑盒(Omega)。

1.1.3主要儀器設(shè)備手術(shù)顯微鏡(YZ20T4，蘇州六六視覺科技股份有限公司)；超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司)；裂隙燈(SL.8Z，日本Topcon)；解剖顯微鏡(Discovery V20，德國Zeiss)；熒光顯微鏡(Eclipse 80i，日本Nikon)；單光子共聚焦熒光顯微鏡(NikonC1Si，日本)；移液器(法國Gilson)；角膜剪和顯微無齒鑷(蘇州明仁醫(yī)療器械廠)；環(huán)鉆(2mm，美國)；高爾夫刀(Accutome，美國)；分析天平(PL402-L，瑞士)。

1.2方法

1.2.1誘導(dǎo)小鼠腸道真菌菌群失調(diào)利用抗真菌藥物兩性霉素B誘導(dǎo)小鼠腸道真菌菌群失調(diào)，選取體質(zhì)量均一(23±2g)、角膜無病變小鼠60只，隨機(jī)分為兩組：兩性霉素B組(Amph)與對照組(Ctrl)。兩性霉素B組按60mg/(kg·d)的劑量將兩性霉素B加入小鼠飲食中喂養(yǎng)4wk[13]，對照組正常飲食喂養(yǎng)4wk。

圖1 角膜分區(qū)模式示意圖(1區(qū)為角膜緣區(qū)，5區(qū)為角膜中央?yún)^(qū))。

1.2.2小鼠糞便樣本收集和DNA提取飼養(yǎng)4wk后將待取樣小鼠放入鋪有滅菌濾紙的籠子內(nèi)，每籠1只小鼠，排便后立即用無菌棉簽收集小鼠糞便，不同的小鼠取樣要更換新的濾紙。采集的小鼠糞便參照糞便樣本DNA提取試劑盒使用方法(E.Z.N.A.TMStool DNA Kit)提取樣本DNA。采用包含“GTGAATCATCGARTC”序列的上游引物和包含“TCCTCCGCTTATTGAT”序列的下游引物擴(kuò)增真菌ITS rDNA上的ITS2高變區(qū)，構(gòu)建高通量測序文庫并檢測，然后利用Illumina MiSeq PE250平臺進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)過分析，得到樣本物種信息。

1.2.3小鼠角膜上皮創(chuàng)傷兩性霉素B誘導(dǎo)腸道真菌菌群失調(diào)后，于中午12∶00制作小鼠角膜上皮創(chuàng)傷模型。10g/L戊巴比妥鈉按80mg/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠。解剖顯微鏡下使用環(huán)鉆在小鼠角膜中央標(biāo)記直徑為2mm圓形區(qū)域，采用高爾夫刀機(jī)械性刮除標(biāo)記圓形區(qū)域的角膜上皮細(xì)胞層[5]。以上過程均在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.2.4角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)觀察創(chuàng)傷后0、6、12、18、24、30h采用20g/L熒光素鈉溶液染色兩組小鼠角膜，在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜創(chuàng)傷修復(fù)情況并拍照，通過圖像處理軟件Photoshop CS6(13.0.1)計算創(chuàng)傷區(qū)域面積。

1.2.5角膜免疫熒光標(biāo)記兩組小鼠分別于創(chuàng)傷后0、6、12、18、24、30、36h各時間點(diǎn)分別處死3只小鼠，取角膜組織，修剪角膜去除虹膜、晶狀體等組織，于2%多聚甲醛中固定40min，固定后1×PBS沖洗角膜，添加0.2%Triton-BSA溶液中室溫破膜、封閉30min，然后分別加入FITC/Gr-1、PE/GL3，4℃避光孵育過夜，次日加入1μg/mL DAPI染液，避光室溫染色。染色后取出角膜組織，1×PBS沖洗。將角膜上皮層朝上使用手術(shù)刀片將角膜均勻切割成4瓣平鋪于載玻片上，使用封片膠封片。

1.2.6分裂細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和γδT細(xì)胞定量分析小鼠角膜進(jìn)行免疫熒光染色后，對角膜中分裂細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和γδT細(xì)胞進(jìn)行定量分析。將角膜從角膜緣到角膜中央依次分為1～5區(qū)(圖1)。在單光子共聚焦顯微鏡40倍油鏡下分別計數(shù)角膜兩條直徑上從一側(cè)角膜緣到另一側(cè)角膜緣9個視野DAPI標(biāo)記的分裂細(xì)胞、PE/GL3標(biāo)記的γδT細(xì)胞。單光子共聚焦顯微鏡斷層掃描角膜兩條直徑上第4區(qū)FITC/Gr-1標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞，然后使用Imaris7.2.1軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計。

圖2 兩組小鼠腸道真菌菌群在門、綱水平上的構(gòu)成 A：門水平；B：綱水平(不同顏色表示不同菌群)。

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

表2 兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)分裂細(xì)胞計數(shù)

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

1.2.7角膜上皮厚度測量兩組分別于創(chuàng)傷后24、48、96h各處死3只小鼠，取下完整小鼠眼球，經(jīng)固定、脫水浸蠟、包埋、切片、脫蠟等過程，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，在顯微鏡10倍物鏡下拍攝圖像并使用Image J軟件進(jìn)行角膜厚度定量計算。

2結(jié)果

2.1兩性霉素B誘導(dǎo)后小鼠腸道真菌菌群發(fā)生改變小鼠糞便樣本ITS rDNA測序結(jié)果顯示：兩性霉素B處理4wk后，小鼠腸道真菌菌群多樣性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中Alpha多樣性分析顯示兩組Shannon指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)，其余各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。說明抗真菌藥物處理后腸道真菌菌群的多樣性存在一定程度的差異。腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)分析顯示，在門水平上，兩組間擔(dān)子菌門(basidiomycota)和接合菌門(zygomycota)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032、0.008，圖2A)；在綱水平上，兩組酵母菌綱(saccharomycetes)、黑粉菌綱(ustilaginomycetes)及微球黑粉菌綱(microbotryomycetes)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008、0.016、0.032，圖2B)。結(jié)果證明，兩性霉素B處理后造成小鼠腸道真菌菌群改變。

2.2腸道真菌菌群失調(diào)對小鼠角膜創(chuàng)傷再上皮化的影響角膜上皮創(chuàng)傷后，兩組小鼠角膜均逐漸進(jìn)行修復(fù)，Ctrl組小鼠創(chuàng)傷后24h熒光素鈉染色角膜上皮無著染，而Amph組仍有部分著染，并且創(chuàng)傷后30h仍有著染(圖3A)。Amph組小鼠與Ctrl組小鼠相比，角膜創(chuàng)傷后再上皮化速度明顯延緩(圖3B)。創(chuàng)傷后，兩組分裂細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加，但Amph組上皮層分裂細(xì)胞總數(shù)顯著低于Ctrl組，各時間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。實(shí)驗表明腸道真菌菌群失調(diào)導(dǎo)致小鼠角膜創(chuàng)傷后再上皮化時間延長，上皮層分裂細(xì)胞數(shù)量與Ctrl組相比顯著下降。

圖3 兩組小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的動態(tài)變化 A：創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)熒光素鈉染色顯示創(chuàng)傷面積；B：創(chuàng)傷后各時間點(diǎn)兩組的角膜創(chuàng)傷面積占創(chuàng)傷原始面積百分比(aP<0.05，bP<0.01 vs Ctrl組)。

圖4 兩組小鼠創(chuàng)傷后48h角膜HE染色和上皮層厚度定量 A：創(chuàng)傷后48h角膜上皮組織形態(tài)變化(×100)；B：創(chuàng)傷后48h角膜上皮厚度定量計算(bP<0.001 vs Ctrl組)。

表3 兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)γδT細(xì)胞計數(shù)個/視野)

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

表4 兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)中性粒細(xì)胞計數(shù)個/視野)

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

2.3腸道真菌菌群失調(diào)對小鼠角膜炎癥細(xì)胞的影響通過觀察創(chuàng)傷后炎癥細(xì)胞的數(shù)量變化，說明腸道真菌菌群失調(diào)對炎癥反應(yīng)的影響。兩組γδT和中性粒細(xì)胞數(shù)量在創(chuàng)傷后均明顯增加，但是與Ctrl組相比，Amph組角膜兩條徑線上γδT細(xì)胞數(shù)量顯著下降(表3)，中性粒細(xì)胞數(shù)量也明顯降低(表4)。結(jié)果表明，腸道真菌菌群失調(diào)小鼠創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)降低，炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

2.4腸道真菌菌群失調(diào)對創(chuàng)傷修復(fù)后角膜厚度的影響Amph組小鼠角膜創(chuàng)傷后上皮厚度在創(chuàng)傷后24、48、96h均小于Ctrl組(t24h=2.60，P24h=0.014；t48h=7.58，P48h<0.01；t96h=2.85，P96h=0.007)，創(chuàng)傷后48h時Amph組角膜上皮厚度為10.02±1.62μm，Ctrl組小鼠角膜上皮厚度為14.58±1.97μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖4)。表明腸道真菌菌群失調(diào)小鼠角膜創(chuàng)傷后再上皮化及復(fù)層化能力顯著降低，角膜上皮厚度下降。

3討論

創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)是組織完成修復(fù)的一個必經(jīng)過程[14]。組織創(chuàng)傷后通過一系列的微血管反應(yīng)，大量的炎癥因子和其他因子等刺激微血管擴(kuò)張、血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大、黏附分子表達(dá)增加，促使炎癥細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域遷移、浸潤[15]。角膜創(chuàng)傷后，γδT細(xì)胞在趨化因子CCL20的誘導(dǎo)下聚集在角膜上皮層，γδT細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-17、IL-20和IL-22等炎癥因子，促使中性粒細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域的募集和上皮細(xì)胞的分裂，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)上皮修復(fù)，TCRδ-/-小鼠角膜創(chuàng)傷后表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)的降低、創(chuàng)傷愈合的延遲，在創(chuàng)傷后96h上皮細(xì)胞密度的降低，所以γδT細(xì)胞在角膜創(chuàng)傷后中性粒細(xì)胞在角膜緣血管中的定位和上皮細(xì)胞的有絲分裂至關(guān)重要[4-5,16]。創(chuàng)傷早期，白細(xì)胞的遷移可以促進(jìn)再上皮化，研究表明通過抗體中和法去除中性粒細(xì)胞的小鼠角膜創(chuàng)傷愈合延遲，證明中性粒細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)[17]。本研究中，角膜上皮創(chuàng)傷后，角膜緣γδT細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均迅速增多，中性粒細(xì)胞在創(chuàng)傷后迅速向創(chuàng)傷區(qū)域遷移，但創(chuàng)傷后6、12h中性粒細(xì)胞在第4區(qū)計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是炎癥反應(yīng)初期中性粒細(xì)胞仍未大量遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，但創(chuàng)傷后24h在角膜第4區(qū)浸潤量達(dá)高峰，之后又逐漸恢復(fù)正常。但腸道真菌菌群失調(diào)組γδT細(xì)胞在角膜緣聚集明顯減少，分裂細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞的浸潤減少，導(dǎo)致角膜創(chuàng)傷的愈合延遲，在創(chuàng)傷后24、48、96h角膜上皮厚度均較對照組明顯減少，這也驗證了上述研究的結(jié)果。所以正常的免疫反應(yīng)在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中占有重要地位。

正常的腸道菌群對免疫系統(tǒng)具有重要作用。過去的研究表明，腸道細(xì)菌對調(diào)節(jié)機(jī)體穩(wěn)態(tài)和免疫反應(yīng)至關(guān)重要；然而，近幾年來研究發(fā)現(xiàn)腸道真菌對這些過程也有很大的影響[18-19]。新的研究表明，真菌菌群的破壞可能會對宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響[20-22]。在對慢性酒精性肝硬化、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病的研究中，均發(fā)現(xiàn)腸道真菌菌群多樣性和結(jié)構(gòu)上的改變，這些疾病的發(fā)生和腸道真菌菌群之間關(guān)系密切[13,23]。研究表明在宿主抗真菌的免疫反應(yīng)中NF-κB信號通路發(fā)揮重要作用[24]，并且IL-22、IL-17參與腸道黏膜免疫反應(yīng)，直接參與控制腸道真菌菌群，缺乏IL-22的小鼠胃腸道更易感染念珠菌[18,25]。而NF-κB信號通路被認(rèn)為是與角膜創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)關(guān)系最密切的調(diào)控分子，IL-17和IL-22在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中也有重要的作用[26]。因此我們推測，腸道真菌失調(diào)可能通過多種機(jī)制影響局部和全身免疫狀態(tài)，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞因子環(huán)境、激活不同細(xì)胞類型和釋放代謝物等[22]，從而影響了創(chuàng)傷修復(fù)中炎癥反應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路、炎癥細(xì)胞的遷移和募集、炎癥因子和其他調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步降低了炎癥反應(yīng)并延緩修復(fù)過程。

本實(shí)驗采用屬于近交系的C57小鼠，因其具有基因純合度高、遺傳背景明確、動物模型重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)，所以我們前期很多研究都建立在C57小鼠上，其它品系小鼠是否會有不同的研究發(fā)現(xiàn)，可以作為我們下一步新的研究方向。另外本研究發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物處理后腸道真菌中一些菌群發(fā)生明顯變化，但在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見對這些顯著差異菌屬的研究報道，因此其與機(jī)體免疫反應(yīng)和腸道微生態(tài)的相關(guān)性不甚明確，對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響更是知之甚少。并且腸道真菌和細(xì)菌之間有著密切的拮抗、互利、共生關(guān)系，可以通過物理接觸和分泌分子直接發(fā)生，或者通過改變宿主的免疫反應(yīng)間接發(fā)生[22,27]。那么小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的延遲是由腸道真菌菌群失調(diào)直接導(dǎo)致還是間接的細(xì)菌改變所造成，仍需要后續(xù)大量的實(shí)驗來驗證。本研究雖然發(fā)現(xiàn)腸道真菌菌群的失調(diào)延緩了角膜創(chuàng)傷的修復(fù)，但是未能揭示腸道真菌菌群的具體作用機(jī)制以及與角膜創(chuàng)傷修復(fù)的相互關(guān)系，這將是我們下一步研究的方向和重點(diǎn)。