葉質(zhì)強(qiáng)，馮露，王心潔，鄂松

（湖北省宏源藥業(yè)科技股份有限公司，湖北黃岡 438600）

轉(zhuǎn)氨酶是可催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，普遍存在于動(dòng)植物組織和微生物中作為生物催化劑可用于制備手性胺類化合物，其催化效率高、選擇性強(qiáng)，相比較化學(xué)合成方法具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、立體結(jié)構(gòu)專一、成本低等優(yōu)勢(shì)。酶催化方法制備手性化合物是目前不對(duì)稱合成領(lǐng)域重要的研究方向[4]。

西格列汀是由美國Merck公司開發(fā)生產(chǎn)用于治療Ⅱ型糖尿病的DPP-Ⅳ抑制劑類藥物。由于傳統(tǒng)化學(xué)合成方法條件苛刻，產(chǎn)率較低，導(dǎo)致成本較高，Merck公司通過和Codexis公司合作開發(fā)了一種新型生物催化劑——轉(zhuǎn)氨酶，使用該酶催化200 g/L濃度底物24h轉(zhuǎn)化率達(dá)92%，ee值大于99.5%。該方法路線（圖1）將轉(zhuǎn)化率提高了13%，同時(shí)減少了19%的廢物[6]，因此法獲得了2010年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)，也為藥物的手性合成提供了新方向。

本實(shí)驗(yàn)中使用的是一種來自網(wǎng)絡(luò)節(jié)桿菌（Arthrobacter sp. KNK168）菌野生型（R）-選擇性轉(zhuǎn)氨酶克隆基因，通過構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PE-ATS在大腸桿菌BL21（ED3）中重組突變得到的菌株，可用于表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶催化底物轉(zhuǎn)化西格列汀。為提高酶的表達(dá)活性，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化菌株培養(yǎng)基組成，并對(duì)酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得可高效表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件，為后期放大試驗(yàn)提供了參考和依據(jù)。

圖1 酶催化合成西格列汀路線

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

E.coli Bl21

1.1.2 試劑

胰蛋白胨（以下統(tǒng)稱蛋白胨）和酵母浸粉（以下統(tǒng)稱酵母粉），安琪酵母公司；蔗糖，阿拉丁試劑；誘導(dǎo)劑（IPTG），賽默飛；氨芐青霉素，Borship；底物（CAS：764667-65-4）、西格列汀標(biāo)準(zhǔn)樣，Sigma；其它原料均為國藥分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，氨芐1‰。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、氯化鈉2.0 g/L、磷酸氫二鉀3.0 g/L、磷酸二氫鈉1.0 g/L、氨芐1‰。

1.1.4 儀器設(shè)備

SX-700蒸汽滅菌鍋（日本TOMY）；TGL-20MS離心機(jī)（湘儀）；Scientz-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝）；C-MAG HS 10 digital攪拌器（IKA）；HZQ-311C搖床（上海一恒）；L5/UV759紫外分光光度計(jì)（上海精密）；垂直型槽電泳儀（北京君意）；ME104分析天平（梅特勒）；高效液相色譜儀（安捷倫1260）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

工程菌保存：將菌種劃線于LB（Amp）固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB（Amp）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期按1 ：1比例加入30%甘油水溶液，分裝100 μL/管，放置-80 ℃保存。

菌種活化：從冰箱中取1支菌種，快速融化，按1%量接種于含LB培養(yǎng)基的試管中，加入1‰的氨芐青霉素，置于37 ℃搖床中，210 r/min培養(yǎng)12 h。

1.2.2 發(fā)酵條件

培養(yǎng)基裝液量為搖瓶體積的1/5，加入1‰氨芐青霉素，接種量2%，溫度37 ℃，搖床180 r/min，培養(yǎng)4 h，加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。

1.2.3 菌體濃度（OD600）測(cè)定

發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，在分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值（要求每次讀數(shù)≤0.8），每個(gè)樣測(cè)量3次，取平均值作為結(jié)果，然后乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵液OD600值。

1.2.4 表達(dá)量檢測(cè)

SDS-PAGE檢測(cè)酶的表達(dá)情況：配制12%分離膠+5%濃縮膠，取1 mL發(fā)酵液離心收集菌體，加入上樣緩沖液100 μL，開水煮沸，置于冰上10 min，取上清10 μL上樣，80 V電泳過濃縮膠，換110 V至結(jié)束?？捡R斯亮藍(lán)染色2 h，甲醇-醋酸混合液脫色過夜。

1.2.5 酶活性測(cè)定

將發(fā)酵液離心得到菌絲體，加入緩沖液充分混勻并用超聲波破碎，催化一定濃度的底物轉(zhuǎn)化為西格列汀，使用高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)生成物峰面積（圖2），與標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度峰面積對(duì)比并計(jì)算出底物單位時(shí)間轉(zhuǎn)化量，得出酶活性。以西格列汀標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積（測(cè)3次取平均值）為縱坐標(biāo)（Y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。酶活定義：按照酶活性試驗(yàn)與檢測(cè)方法，1 min 催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為西格列汀所需的酶量為一個(gè)活力單位(U)。

酶活性試驗(yàn)與檢測(cè)方法 取1 mL發(fā)酵液離心，去掉上清，加入等體積PBS，超聲破碎30 s再分別加入45% DMSO、10 g/L底物、2.0 mol/L異丙胺鹽、1 mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），異丙胺調(diào)節(jié)pH值為8.5，反應(yīng)總體積為3 mL，在45 ℃下反應(yīng)30 min后立即取出，快速加入等量乙腈充分混勻，離心，取上清液微濾稀釋后通過HPLC檢測(cè)。條件為：安捷倫1260機(jī)型，SB-C18/ 4.6×150 mm/5μm色譜柱，流動(dòng)相為0.1%磷酸-水溶液/乙腈，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速 1 mL/min。

圖2 西格列汀與底物HPLC圖

圖3 西格列汀濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化

以發(fā)酵液OD600為指標(biāo)，考察碳源、氮源和無機(jī)鹽對(duì)其影響。單因素實(shí)驗(yàn)分別選用葡萄糖、甘油、蔗糖作為碳源，濃度為3、6、9、12、15 g/L和18 g/L；蛋白胨、酵母粉、玉米作為氮源，濃度為4、8、12、16、20 g/L和24 g/L；正交實(shí)驗(yàn)選用硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉4種無機(jī)鹽確定最優(yōu)配比，條件見表1。

表1 無機(jī)鹽濃度正交實(shí)驗(yàn)因素與水平 （單位g/L）

1.2.7 發(fā)酵誘導(dǎo)條件優(yōu)化

以酶活性和表達(dá)量作為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)分別選取不同誘導(dǎo)溫度分別為28、30、32、34、36、38、40 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間分別為 2、4、6、8、10、12h，誘導(dǎo)劑濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。以上培養(yǎng)條件均同實(shí)驗(yàn)方法（2.2.2），每次實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)結(jié)果將置換下一次實(shí)驗(yàn)其他同因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源及其濃度選擇

碳源是組成細(xì)胞成分的碳架，為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝提供能源，常見的碳源有甘油、葡萄糖，蔗糖、可溶性淀粉等[8]。由圖4可知：甘油從3 g/L增加到6 g/L時(shí)菌生長(zhǎng)速率最快，到9 g/L時(shí)OD達(dá)到最高，繼續(xù)增加濃度呈下降趨勢(shì)；隨著葡萄糖濃度增加OD600快速增長(zhǎng)，當(dāng)濃度大于9 g/L后增長(zhǎng)緩慢；蔗糖濃度對(duì)菌密度影響趨勢(shì)與葡萄糖相似，但低于葡萄糖。綜合分析，選用甘油作為培養(yǎng)基碳源，濃度為9 g/L。

圖4 不同碳源及其濃度對(duì)菌密度影響

2.2 不同氮源及其濃度選擇

氮源作為細(xì)胞蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物合成的重要營養(yǎng)物質(zhì)，一般可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮兩大類，常見有機(jī)氮源有蛋白胨、酵母粉、玉米漿等，無機(jī)氮源主要有硝酸鹽和銨鹽類。實(shí)驗(yàn)室常用有機(jī)氮源，可為菌提供豐富的蛋白質(zhì)、多肽及不同的微量元素和生長(zhǎng)因子，有利于蛋白質(zhì)的合成與表達(dá)。由圖5可知，酵母粉作氮源，當(dāng)其濃度在16 g/L時(shí)增長(zhǎng)速度和OD600最高；使用蛋白胨濃度增長(zhǎng)速度變緩；玉米粉作氮源菌密度相對(duì)偏低。因此選用酵母粉作為氮源，濃度為16 g/L。

2.3 不同濃度無機(jī)鹽配比對(duì)菌生長(zhǎng)影響。

無機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)和代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是構(gòu)成細(xì)胞的組織成分，具有維持酶的活性、調(diào)節(jié)滲透壓等作用[7]。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫酸銨對(duì)菌體生長(zhǎng)影響最為顯著，氯化鈉影響作用最小。影響主次硫酸銨＞磷酸氫二鈉＞磷酸二氫鉀＞氯化鈉；最優(yōu)配比組合A2D2C3B2，依次濃度為硫酸銨4.0 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉6.0 g/L，見表2、表3。

圖5 不同氮源及其濃度對(duì)菌密度影響

表2 無機(jī)鹽配比優(yōu)化結(jié)果與分析

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 不同溫度下誘導(dǎo)結(jié)果

由圖6、圖7可知，酶活性和表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度的上升而增加，在36 ℃活性達(dá)到最大；繼續(xù)升溫，出現(xiàn)較多雜蛋白，酶活性也快速降低，溫度過高和過低都不利于酶的表達(dá)。因此，在36 ℃條件下誘導(dǎo)最適宜。

圖6 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活性影響

圖7 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)酶表達(dá)量影響 （28-40℃）

2.5 不同誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)果

由圖8、圖9得知，酶活性在誘導(dǎo)4 h后最大，隨著時(shí)間的增加，包涵體濃度增加，酶活性有所下降。因此，選擇誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為4 h。

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活性影響

圖9 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶表達(dá)量影響

2.6 不同誘導(dǎo)劑濃度下誘導(dǎo)結(jié)果

由圖10、圖11可知，在誘導(dǎo)劑濃度為0.8 mmol/L時(shí)，酶表達(dá)量最高，活性最高。濃度從0增加到0.6 mmol/L，酶活性也快速增加，濃度從0.6增加至0.8時(shí)，酶活性增量不明顯，繼續(xù)增加誘導(dǎo)劑濃度對(duì)酶活性沒有明顯影響。因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇0.6 mmol/L濃度適宜。

圖10 不同濃度誘導(dǎo)劑對(duì)酶活性影響

圖11 不同濃度誘導(dǎo)劑對(duì)酶表達(dá)量影響

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)可以看出，甘油作碳源更適合菌的生長(zhǎng)，可能相對(duì)于葡萄糖不容易產(chǎn)酸、乙醇等有害代謝物；使用蛋白胨作為氮源菌生長(zhǎng)更快一些，最后隨著濃度的增加兩者OD值基本達(dá)到一致，發(fā)酵過程中多采用二者搭配使用來促進(jìn)菌體更高密度的增長(zhǎng)；添加無機(jī)鹽對(duì)菌的生長(zhǎng)代謝有促進(jìn)作用，其中硫酸銨對(duì)菌密度影響最大，可能是氮元素的增加促進(jìn)了菌的生長(zhǎng)；誘導(dǎo)條件作為影響酶表達(dá)和活性關(guān)鍵因素，通過SDSPAGE分析酶表達(dá)量和HPLC測(cè)定酶催化活性發(fā)現(xiàn)二者變化趨勢(shì)基本一致，說明表達(dá)量與酶活性呈一定的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)最終確定培養(yǎng)基條件為葡萄糖9 g/L、蛋白胨16 g/L、硫酸銨4.0 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉6.0 g/L；最佳誘導(dǎo)條件為37 ℃下加入0.6 mmol/L誘導(dǎo)劑（IPTG）誘導(dǎo)4 h結(jié)束發(fā)酵。通過驗(yàn)證使用以上條件下培養(yǎng)最終得到的菌OD600可達(dá)到6.63，轉(zhuǎn)氨酶可溶表達(dá)量約占可溶蛋白總量的50%，轉(zhuǎn)氨酶活性可達(dá)758 U/L。