李敏，敬小莉，談文林

（1.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州 635000；2.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川達(dá)州 635000）

何首烏作為傳統(tǒng)的大宗中藥材，具有極高的藥用價(jià)值。其根部入藥，具有活絡(luò)、養(yǎng)血、安神、消癰、解毒（截瘧）等功效[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，何首烏中主要含有二苯乙烯苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)、磷脂類(lèi)和黃酮類(lèi)等具有生物活性和藥理作用的化合物[4-5]。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）是何首烏的主要藥效成分，具有抗氧化、抗衰老、抗老年癡呆、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇和防止動(dòng)脈硬化等藥理作用[6-7]，其含量作為何首烏及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[8]。目前，對(duì)何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的研究主要集中在提取方法及提取物的活性研究方面，對(duì)于何首烏中二苯乙烯苷的分離純化及其抗氧化活性方面研究較少。因此發(fā)展一種能將提取液進(jìn)行分離純化，并將純化產(chǎn)物用于有針對(duì)性的抗氧化活性研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

大孔吸附樹(shù)脂是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種具有高效吸附性能的有機(jī)聚合物吸附劑，具有化學(xué)性能穩(wěn)定、選擇性高、再生簡(jiǎn)單和高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化工藝[9-10]。本文以四川達(dá)州產(chǎn)何首烏為研究對(duì)象，通過(guò)超聲波輔助提取技術(shù)提取何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)，采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并對(duì)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了篩選，為二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。將分離純化產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性研究，檢測(cè)何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)對(duì)·OH和DPPH·的清除能力，以及還原力測(cè)定，為深入開(kāi)發(fā)利用四川達(dá)州產(chǎn)何首烏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

何首烏（40 ℃條件下干燥后粉碎過(guò)60目篩）：四川達(dá)州產(chǎn)；二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130型大孔吸附樹(shù)脂：上海源葉生物科技有限公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）：美國(guó)Sigma公司；六氰合鐵酸鉀（K3[Fe(CN)6]）、抗壞血酸（Vc）、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4）：國(guó)藥集團(tuán)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）、SHZD3000型多功能全自動(dòng)振蕩儀（上海電氣有限公司）、DZX-6022B真空干燥箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、FS-900N超聲波中藥提取儀（上?？破顑x器設(shè)備有限公司）、FA1004N電子分析天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用無(wú)水乙醇溶解后定容至25 mL，即得200 mg/L二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取200 mg/L二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和3.5 mL置于8個(gè)25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，分別測(cè)定不同濃度在322 nm下的吸光度，測(cè)定3次取平均值，以吸光度A（Abs）為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)作圖，得二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1所示。線(xiàn)性回歸方程y=0.0567x+0.0083，相關(guān)系數(shù)R為0.9999，通過(guò)測(cè)定樣品溶液的吸光度，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算樣品溶液中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的含量（mg/L）。

圖1 二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.3.2 樣品中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的提取、測(cè)定及上柱液的制備

二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的提取及測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法改進(jìn)，稱(chēng)50.0 g的何首烏粉末，以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇作溶劑，料液比為1∶25（g∶mL），采用800 W超聲提取，在65 ℃下提取1.5 h，重復(fù)2～3次，將提取液過(guò)濾，即得待測(cè)液。由于1.3.1中二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品在322 nm波長(zhǎng)下有特征吸收峰，因此取適量待測(cè)溶液于322 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得到二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的濃度（C），按公式（1）計(jì)算苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)提取率為7.83%。將提取液減壓濃縮，蒸干得二苯乙烯苷粗提物，根據(jù)1.3.1中方法對(duì)二苯乙烯苷的純度進(jìn)行測(cè)定，粗提物二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)純度為34.62%，將粗提物用適量無(wú)水乙醇溶解，即得上柱液。

其中：C表示二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的濃度，g/mL；V表示樣品的體積，mL；M表示何首烏質(zhì)量，g。

喬治·華盛頓大學(xué)兒童心理學(xué)教授葛林斯班認(rèn)為：“感情能力不只是未來(lái)發(fā)展親密關(guān)系與依賴(lài)的基石，也是智能與許多認(rèn)知能力的基礎(chǔ)。在孩子不同的發(fā)展時(shí)期，感情能力都扮演主導(dǎo)的角色，學(xué)習(xí)與認(rèn)知技巧則跟隨其后。即使是數(shù)學(xué)能力，表面看來(lái)是與個(gè)人無(wú)關(guān)，是絕對(duì)屬于認(rèn)知技巧的領(lǐng)域，其實(shí)也是透過(guò)感情來(lái)學(xué)習(xí)。例如：‘很多’對(duì)一個(gè)2歲的孩子而言，指的是超乎他所預(yù)期的；‘很少’是指比他想要的還少。”

1.3.3 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理與再生

將市售大孔吸附樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用適量乙醇洗至流出液與蒸餾水1∶5混合無(wú)渾濁現(xiàn)象，再用5%的鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%的氫氧化鈉溶液浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹(shù)脂完成預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)使用過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂，先用5%鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%氫氧化鈉浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹(shù)脂即可再次使用。

1.3.4 大孔吸附樹(shù)脂吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g預(yù)處理過(guò)的干大孔吸附樹(shù)脂，裝入錐形瓶中，加入已知濃度的何首烏二苯乙烯苷提取液50 mL，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹(shù)脂充分吸附二苯乙烯苷后，取上層清液測(cè)定二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的濃度，按公式（2）、（3）計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的吸附量（Q1）和吸附率（E）[12]。

其中：Q1表示吸附量，mg/g；C0表示溶液初始濃度，mg/mL；C1表示完成吸附后溶液濃度，mg/mL；E表示吸附率；M表示大孔吸附樹(shù)脂的質(zhì)量，g。

將吸附飽和后的干大孔吸附樹(shù)脂加入50 mL無(wú)水乙醇，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹(shù)脂充分解吸二苯乙烯苷后，取上層清液測(cè)定二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的濃度，按公式（4）、(4)計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的解吸量（Q2）和解吸率（D）[13]。

其中Q2表示解吸量，mg/g；C2表示解吸液濃度，mg/mL；D表示解吸率。

1.3.5 二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的分離純化

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 清除羥基自由基（·OH）活性測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)[14-15]，分別取純化二苯乙烯苷和Vc進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見(jiàn)圖3）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液1 mL，6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和0.1%的H2O2溶液1 mL，搖勻后靜置5 min，然后加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，用蒸餾水定容，搖勻后在37 ℃水浴30 min，離心后在510 nm處測(cè)定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用1 mL的蒸餾水代替，測(cè)定其吸光度為A0，將體系中H2O2溶液用1 mL蒸餾水代替，測(cè)定其吸光度為A1，按公式（6）計(jì)算純化二苯乙烯苷和Vc對(duì)·OH的清除率。

其中：E表示清除率；A0表示未加樣品的吸光度；A1表示未加雙氧水的吸光度；A2表示加入樣品的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH·活性測(cè)定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見(jiàn)圖4）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL，用無(wú)水乙醇定容后搖勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用2 mL無(wú)水乙醇代替，測(cè)定其吸光度為A0，將體系中DPPH·乙醇溶液用2 mL無(wú)水乙醇代替，測(cè)定其吸光度為A1，按1.3.6.1方法計(jì)算純化二苯乙烯苷和Vc對(duì)DPPH·的清除率。

1.3.6.3 還原力測(cè)定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在25 mL容量瓶中分別加入不同濃度（見(jiàn)圖5）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2.5 mL，1.0%六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）2.5 mL，搖勻后50 ℃水浴20 min，冷卻后加入10%醋酸2.5 mL和0.1%氯化鐵溶液2.5 mL，用蒸餾水定容，搖勻后靜置10 min，離心后在700 nm處測(cè)定其吸光度，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷和Vc比較，吸光度越大，其還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

依據(jù)1.3.4方法，將大孔吸附樹(shù)脂S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130用于何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)的靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，不同種類(lèi)樹(shù)脂的吸附率和解吸率不同。從吸附率的數(shù)據(jù)可以看出，NKA-9樹(shù)脂吸附率最高；從解吸率的數(shù)據(jù)可以看出，S-8樹(shù)脂解吸率最高，NKA-9樹(shù)脂次之，但兩者差別不大。從表1中數(shù)據(jù)綜合考慮吸附-解吸效果，NKA-9樹(shù)脂效果最好，因此選擇NKA-9樹(shù)脂對(duì)何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分離純化。

表1 吸附-解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 NKA-9大孔樹(shù)脂吸附實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以二苯乙烯苷上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）四因素為變量，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，方案設(shè)計(jì)見(jiàn)表2所示。

表2 因素水平表

以NKA-9大孔樹(shù)脂對(duì)二苯乙烯苷的吸附率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表3的極差分析可知，樹(shù)脂吸附效果的影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即二苯乙烯苷上樣液濃度（A）對(duì)吸附率影響最大，其次是上樣量（C）和上樣速度（B），最后是乙醇濃度（D）。由k值得出NKA-9大孔樹(shù)脂對(duì)二苯乙烯苷的最佳吸附條件為：A2B2C2D1，即上樣液濃度為3.5 mg/mL、上樣速度為3.0 BV/h、上樣量為3.0 BV和乙醇濃度70%。

2.3 NKA-9大孔樹(shù)脂解吸實(shí)驗(yàn)

在二苯乙烯苷解吸過(guò)程中，首先用石油醚和乙酸乙酯混合液（體積比2∶1）洗脫，除掉二苯乙烯苷粗提物中的極性較小的揮發(fā)油、脂類(lèi)和色素等，再用無(wú)水乙醇以流速3.0 BV/h洗脫，TLC監(jiān)測(cè)，按BV收集洗脫液，按1.3.1方法測(cè)定各段洗脫液二苯乙烯苷的含量（mg/mL），得到解析曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2所示。

由圖2可知，在收集的各段洗脫液中，隨著洗脫液體積的增加，二苯乙烯苷的含量先增加再降低，到第4BV洗脫液時(shí)，二苯乙烯苷已基本洗脫完全，因此可以確定選用洗脫液用量為4BV進(jìn)行解吸。

圖2 大孔樹(shù)脂解吸曲線(xiàn)

2.4 清除羥基自由基（·OH）作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用比較，設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 二苯乙烯苷和Vc對(duì)·OH的清除能力

由圖3可知，在所選實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除羥基自由基（·OH）的能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定。其中純化二苯乙烯苷濃度為35 mg/L時(shí)，純化二苯乙烯苷對(duì)·OH的清除率達(dá)到72.72%，說(shuō)明純化二苯乙烯苷對(duì)羥基自由基（·OH）有較好的清除能力。

2.5 清除DPPH·作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對(duì)DPPH·的清除作用比較，設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在所選實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除DPPH·的能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定。其中純化二苯乙烯苷濃度為14 mg/L時(shí)，純化二苯乙烯苷對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到78.73%，結(jié)果表明，純化二苯乙烯苷對(duì)DPPH·有較好的清除能力。

圖4 二苯乙烯苷和Vc對(duì)DPPH·的清除能力

2.6 還原力分析

一般而言，物質(zhì)的還原力與抗氧化能力之間具有相關(guān)性，物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)，還原力越強(qiáng)。以純化二苯乙烯苷和Vc對(duì)Fe3+的還原力比較，設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 二苯乙烯苷和Vc的還原力

還原力測(cè)試實(shí)驗(yàn)是根據(jù)Fe3+被還原為Fe2+，純化二苯乙烯苷和Vc還原六氰合鐵酸鉀后，生成普魯士藍(lán)，在700 nm處出現(xiàn)最大吸收。由圖5可知，在所選實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc的還原力隨著濃度的增加而增大，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷的還原力約為Vc的40%，雖然純化二苯乙烯苷的吸光度值低于Vc，但純化二苯乙烯苷也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的還原力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲波提取技術(shù)，從何首烏中提取得到了二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)，提取率為7.83%，粗提物二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)純度為34.62%。通過(guò)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的吸附-解吸實(shí)驗(yàn)考察，篩選出了效果最佳的NKA-9樹(shù)脂；采用石油醚、乙酸乙酯和無(wú)水乙醇對(duì)何首烏二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)粗提物進(jìn)行梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)，制備得到純化二苯乙烯苷類(lèi)化合物，純度為72.68%。通過(guò)純化二苯乙烯苷類(lèi)化合物與Vc抗氧化活性和還原力比較研究，二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)對(duì)·OH和DPPH·的清除率分別達(dá)到72.72%和78.73%，還原力約為同濃度Vc的40%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，何首烏中二苯乙烯苷類(lèi)物質(zhì)具有較好的抗氧化活性和較強(qiáng)的還原能力。