許心銘，胡大偉，付玉明，張金暉，劉紅

（北京航空航天大學 生物與醫(yī)學工程學院 環(huán)境生物學與生命保障技術(shù)研究所，北京 100083）

引 言

電離輻射對微生物具有殺傷作用，高劑量電離輻射可用于消毒滅菌，因此對于微生物來說，電離輻射是一種逆境因子。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在低劑量電離輻射（Low-Dose Ionizing Radiation，LDIR）環(huán)境下，微生物卻能夠很好地生長。與無電離輻射的自然環(huán)境相比，它們不僅數(shù)量眾多，而且種類異常豐富[1-6]。LDIR是指劑量低于200 mGy或劑量率低于0.1 mGy/min的電離輻射。例如空間站外表面由于有一層厚厚的防護，可以抵擋高能量宇宙射線，因此其內(nèi)部的生物一直處于LDIR環(huán)境中（輻射強度約為地面的120倍）。截止目前，國際空間站上已發(fā)現(xiàn)了84種微生物，其中細菌49種，包括葡萄球菌、鏈球菌和桿菌等；真菌35種，包括黃曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、桔灰曲霉、臘葉芽枝霉、枝狀枝孢霉和細基格孢霉等。經(jīng)分析，空間站微生物菌落的生物多樣性大大高于地面上無電離輻射的類似環(huán)境下滋生的微生物菌落[1,7]。空間站微生物的大量滋生危害極大，已知某些微生物種類不僅會嚴重威脅宇航員的健康，而且還會加速設(shè)備和元器件的腐蝕，導致空間站運行異常，極大地危害著航天任務的安全[1,8]。

然而據(jù)統(tǒng)計空間站可被微生物利用的底物種類不超會過30種[1]，而生態(tài)學中的競爭排斥原理（Competitive Exclusion Principle）闡明在同一營養(yǎng)級上如果多種生物穩(wěn)定共存的話，那么生物的種類數(shù)目不能多于可獲得資源的種類數(shù)目，否則就會出現(xiàn)競爭排斥現(xiàn)象，競爭的結(jié)果只有少數(shù)生物種群（經(jīng)生態(tài)位分化后）可以共存[10]。那么為什么在空間站LDIR環(huán)境下，當微生物的種類數(shù)目大大多于生長基質(zhì)的情況下，微生物種群之間并沒有發(fā)生明顯的競爭排斥現(xiàn)象，微生物群落卻呈現(xiàn)出生物多樣性穩(wěn)定響應，目前仍沒有一個令人滿意的解釋。

Kudryasheva發(fā)現(xiàn)海洋細菌對LDIR的響應過程包括明顯的3個階段—延遲期、促進期和抑制期[9]，閔銳等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一段緩慢生長的適應期后，LDIR可誘導生物細菌產(chǎn)生“適應性反應”和“興奮（Hormesis）效應”[11]。美俄合作在國際空間站執(zhí)行的名為“Biorisk”空間微生物研究試驗，從2005年1月開始，歷時1.5年，采用的是生存能力較強的真菌孢子。將微生物的孢子分別在太空培養(yǎng)7個月、12個月和18個月后取回樣品。實驗結(jié)果表明，在外太空環(huán)境下微生物分泌出很多類型的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多糖和有機酸等，它們能導致并加劇金屬及高分子材料的腐蝕。他們通過電鏡掃描觀察了實驗前后微生物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于細菌如枯草芽孢桿菌，實驗后細胞結(jié)構(gòu)不再完整—被分割成了很多段；對于真菌如雜色曲霉，實驗后其外壁上形成了一層多糖，它正是在這層多糖的保護下才存活下來。同時仍有研究表明，細菌和真菌細胞在LDIR環(huán)境下能夠自身快速修復受損DNA，改變碳源利用類型，并通過化學結(jié)果分析觀察到細胞內(nèi)的脂肪含量有所增加[6]。

因此本研究提出在LDIR環(huán)境中：①在微生物群落的演替早期，由于LDIR對不同種群產(chǎn)生了不同強度的生長時滯作用，從而在較短時間內(nèi)有效地減弱了它們之間的相互競爭作用，使它們免于初期的競爭排斥。②初期各種群不同強度生長時滯很可能造成各個微生物種群數(shù)量呈現(xiàn)出不同相位的異步趨同波動，這將會在今后大大減小微生物群落內(nèi)部的競爭作用，使微生物群落能夠達到生物多樣性平衡。選用太空中常見的優(yōu)勢微生物菌群，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌進行培養(yǎng)，通過實驗觀測該群落為響應LDIR內(nèi)部發(fā)生的變化，探究其中所包含的動力學機制，并于計算機仿真相結(jié)合，驗證了上述假說，為科學認識LDIR環(huán)境下微生物群落的復雜演替過程，以及其中物種多樣性的產(chǎn)生和維持機制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 特殊環(huán)境模擬培養(yǎng)箱

為了研究空間LDIR環(huán)境下，微生物群落物種多樣性的產(chǎn)生和維持機制，北京航空航天大學環(huán)境生物學與生命保障技術(shù)研究所研發(fā)了能夠模擬空間LDIR環(huán)境的“特殊環(huán)境模擬培養(yǎng)箱”（圖1），采用X-射線發(fā)生器誘導箱內(nèi)的空氣發(fā)生電離，形成等離子體，在箱內(nèi)的不同位置處放置6個培養(yǎng)皿，箱內(nèi)微生物會接受到不同強度的電離輻射，培養(yǎng)基采用Luria-Bertani，溫度為23°C，氣壓為100 kPa，相對濕度為30%～70%（與空間站環(huán)境一致）。

1.2 微生物短期培養(yǎng)后細胞形貌觀察

1）目標菌株初期培養(yǎng)：分別取金黃葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌電離活化菌液和金黃葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌非電離活化菌液適量，以10%的濃度接種于含有EPDM基材的無機鹽培養(yǎng)基中，分別置于“特殊環(huán)境模擬培養(yǎng)箱”（有LDIR）及ZWYR-D2401型微生物智能培養(yǎng)箱（無LDIR）中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

圖1 特殊環(huán)境模擬培養(yǎng)箱及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖（其中①②③④⑤⑥為接種培養(yǎng)皿的位置）Fig.1 LDIR environment simulator and its 3D geometric configuration（where ①②③④⑤⑥ are the location of the petri dishes）

2）標準菌株固定：分別對1）中提到的各標準菌進行12 h及24 h培養(yǎng)液取樣，各樣品在1 500 r/min離心10 min，棄上清液，然后加入1%戊二醛固定液，固定50 min。不時搖動，使菌落細胞均勻分布于固定液中。

3）離心：細胞固定液經(jīng)1 500 r/min離心10 min，棄上清液，使細胞與固定液分離。

4）漂洗：然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗2次，離心，棄上清液。

5）涂片：用潔凈的鉑金環(huán)取菌落細胞，在小蓋片上涂一薄層（涂2～3個樣品，以免脫水過程中細胞流失），待固定后進行乙醇脫水。

6）脫水：用50%、70%、80%、90%、95%梯度的乙醇分別依次脫水，每次10 min，最后用無水乙醇脫水2次，每次10 min。

7）臨界點干燥：將脫水后的樣品轉(zhuǎn)入中間液乙酸異戊脂中，置換乙醇。在臨界點干燥器的樣品室內(nèi)，用液態(tài)二氧化碳置換乙酸異戊脂。在達到臨界狀態(tài)（31℃，72.3 atm）后，將溫度升至40℃，使液態(tài)CO2完全氣化，然后打開放氣閥門，逐漸排出氣體，使樣品完全干燥。取出后，置于普通干燥器中。

8）電子顯微鏡觀察：將干燥后的樣品放入真空泵鍍儀的玻璃罩內(nèi)，使樣品表面噴鍍一層鉑金屬膜，然后置于JSM-6700F型掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）下觀察各種微生物細胞外部形貌。

9）同時對2）中各樣品采用FDA/PI微生物活死細胞染色，于激光共聚焦顯微鏡下觀察各種微生物的熒光染色情況，對照7）所得SEM照片，確定微生物在初期培養(yǎng)過程中活細胞外部形貌的變化。

1.3 建模與仿真

由于微生物群落各物種之間的基本生態(tài)關(guān)系是競爭，因此種群變化的動力學機制應符合經(jīng)典Lotka-Volterra競爭方程。本研究在此方程的基礎(chǔ)上，將LDIR誘導產(chǎn)生的種群生長延遲時間引入其中，得到LDIR環(huán)境下微生物種群變化的動力學模型。在MatLab/Simulink平臺上，把微生物群落演替的延遲微分方程動力學模型轉(zhuǎn)變?yōu)榉抡婺Ｐ?，進行大規(guī)模的計算機數(shù)值仿真實驗，最終確定LIDR環(huán)境下，微生物群落中物種多樣性的產(chǎn)生與維持機制[12-13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 短期LDIR環(huán)境下微生物細胞的形貌觀察

利用SEM觀察微生物細胞形態(tài)和表面超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究，按照常規(guī)方法對培養(yǎng)初期的單菌落細胞進行SEM觀察前的處理。以實驗標準菌株大腸桿菌為例，所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 大腸桿菌初期培養(yǎng)細胞形貌SEM觀察圖Fig.2 E.coli morphological observation by SEM at earlier culture stage

圖2中A、C、E依次為非LDIR條件下大腸桿菌初期培養(yǎng)0 h、12 h、24 h的細胞形貌，B、D、F依次為低劑量電離輻射條件下大腸桿菌初期培養(yǎng)0 h、12 h、24 h的細胞形貌。對比可以看出，大腸桿菌在非LDIR條件下，其菌株的細胞形貌經(jīng)歷了飽滿圓潤到部分褶皺，最后細胞部分裂解的變化過程，而在LDIR條件下同時期微生物的細胞體并沒有發(fā)生裂解，只是保持著更嚴重的褶皺狀態(tài)。A圖是剛接種時的非LDIR下大腸桿菌活化菌株形貌，此時接種菌株處于活化對數(shù)生長期，其細胞表面光滑；C圖是在正常環(huán)境（非LDIR）下經(jīng)過12 h培養(yǎng)大腸桿菌的細胞形貌圖，只有少數(shù)菌株形貌出現(xiàn)表面褶皺；E圖是在正常環(huán)境下培養(yǎng)24 h下大腸桿菌的細胞形貌圖，細胞表面的褶皺進一步加深，部分細胞甚至開始裂解死亡。相比而言，大腸桿菌在LDIR下，同一生長時期，其細胞形態(tài)與非LDIR下的有明顯差別，12 h的初期培養(yǎng)后僅有部分細胞表面出現(xiàn)不明顯得褶皺現(xiàn)象，而培養(yǎng)24 h后同樣僅出現(xiàn)褶皺并未發(fā)現(xiàn)有裂解的現(xiàn)象。由此可見，LDIR對大腸桿菌的形貌產(chǎn)生明顯影響。為了對細胞形貌狀況進一步分析，選用兩種細胞活性染色試劑二乙酸熒光素（Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）檢測細胞活性。FDA/PI廣泛應用于檢測微生物細胞的活性。FDA能夠進入菌體細胞，在細胞內(nèi)非特異性脂酶催化作用下，本身不具有熒光的物質(zhì)FDA生成熒光素，經(jīng)480 nm激光激發(fā)出波長為530 nm左右綠色熒光，死細胞具有不完整的細胞膜，生成的熒光素易擴散，難以檢測到綠色熒光的死細胞；PI難以進入具有完整細胞膜的活細胞，當菌體細胞細胞膜不完整時，進入細胞的PI與DNA結(jié)合，在488 nm激光激發(fā)下，可以檢測到紅色熒光。FDA/PI雙染色方法是利用活死細胞經(jīng)染色后會激發(fā)出不同波長的熒光特點來判斷細胞活性的。以初期培養(yǎng)24 h的大腸桿菌樣品為例，其FDA/PI雙染色觀察結(jié)果如圖3所示。

圖3是對初期培養(yǎng)24 h后的大腸桿菌樣品進行FDA/PI雙染色的結(jié)果，圖A～C是非LDIR下大腸桿菌試樣的染色結(jié)果，圖D～F是在LDIR下大腸桿菌試樣的染色結(jié)果。圖A、D是FDA的染色結(jié)果，圖B、E是PI染色結(jié)果，圖C、F是FDA/PI雙染色后疊加結(jié)果。從圖3可以看出，初期培養(yǎng)約24 h的大腸桿菌試樣，在無LDIR下絕大多數(shù)微生物個體處于死亡狀態(tài)，而在電離輻射條件下大腸桿菌細胞個體沒出現(xiàn)大量死亡，只有少數(shù)個體死亡。大腸桿菌細胞體的FDA/PI染色結(jié)果更直觀地驗證SEM結(jié)果，更有力地說明微生物個體為了適應LDIR的影響，其細胞表面出現(xiàn)褶皺且微生物個體保持活性狀態(tài)，從實驗上證實了LDIR使微生物在培養(yǎng)初期產(chǎn)生明顯時滯效應的假設(shè)。

圖3 初期培養(yǎng)24 h大腸桿菌樣品的FDA/PI雙染色Fig.3 Double staining of E.coli by FDA/PI at earlier culture stage of 24 h

2.2 微生物種群的延遲Lotka-Volterra競爭模型

經(jīng)典的Lotka-Volterra競爭方程見式（1）可以有效描述不同種群由于對資源的競爭產(chǎn)生的生態(tài)關(guān)系，該生態(tài)關(guān)系決定了各種群數(shù)量的動態(tài)變化過程。

其中：xi表示第i種微生物在t時刻的數(shù)量；ri是它的內(nèi)稟生長率；Ki是它的環(huán)境容量；αij表示第j種微生物對第i種微生物的競爭抑制系數(shù)。

然而在LDIR環(huán)境下，會對微生物群落中的各種群的某些個體產(chǎn)生程度不一的時滯作用，因此本研究提出2個基本假設(shè)：①處于生長時滯狀態(tài)的微生物不再生長和分裂；②處于生長時滯狀態(tài)的微生物也不需要消耗任何外部基質(zhì)。因此式（1）可以改寫成式（2）形式，作為LDIR下微生物種群數(shù)量變化的動力學模型

其中：λi表示第i種微生物種群內(nèi)因LDIR作用產(chǎn)生了生長時滯的個體占總體的百分數(shù)；ωi和τi表示因LDIR導致的第i種微生物產(chǎn)生的時滯，其中ωi表示由自身因素（如在基質(zhì)不足時利用體內(nèi)的能量物質(zhì)）導致的生殖時滯；τi表示LDIR導致的環(huán)境時滯，例如LDIR直接影響微生物內(nèi)部的代謝或誘導產(chǎn)生抑制性的胞外分泌物，從而延遲微生物的生長等。

2.3 微生物種群多樣性產(chǎn)生和維持機制檢驗的仿真實驗

本研究選擇10種微生物，在大量不同的α，r，K和x初始值下，對公式（1）進行數(shù)值仿真實驗，得到的都是類似的結(jié)果（圖4）?？梢钥闯觯挥猩贁?shù)種可以存活下來，其他的種被競爭排斥掉，微生物群落內(nèi)部不可能達到物種多樣性穩(wěn)定。

圖4 由于競爭排斥導致的微生物群落非多樣性穩(wěn)定Fig.4 Microbial community stability without species diversity due to competitive exclusion

如果讓這些微生物種群之間不發(fā)生競爭淘汰，它們必須發(fā)生生態(tài)位分化，導致競爭系數(shù)αij減少，如不同微生物種群利用不同的基質(zhì)生存，相互之間不發(fā)生對基質(zhì)的競爭作用，這樣基質(zhì)的種類必須大于微生物的種類才可保證微生物食性變化的需求，然而這種情況在空間站環(huán)境里是不存在的。

由于LDIR環(huán)境誘導微生物群落各種群中的某些個體產(chǎn)生了生長時滯。這時種群競爭模型變成公式（2）的形式，與公式（1）相比，假如r，K，αij和x初值都保持不變。需要說明的是，由于微生物產(chǎn)生了適應性，因此公式（2）的等號右邊第2項中的r，K等可能與第1項不同，但這里把它們?nèi)∠嗤?，因為即使取不同的值也會呈現(xiàn)相同的規(guī)律。取不同的延遲時間—ωi和τi，假設(shè)延遲僅發(fā)生在第1世代，對公式（2）做仿真實驗，得到大量類似圖5的仿真實驗結(jié)果。

圖5 LDIR的時滯作用導致的微生物群落生物多樣性穩(wěn)定Fig.5 Microbial community stability with species diversity resulting from growth delay by LDIR

從圖5中可以看出，由于LDIR的時滯作用，在微生物群落演替初期各種群免于了競爭排斥，此后種群數(shù)量形成了不同周期的異步趨同波動—不同微生物種群有不同的數(shù)量波動相位，相位之間存在差異，比如種群x2和x4，當x2處于高位時，x4處于低位，反之亦然。而它們之間競爭的強弱是由x2，x4決定的，因此它們之間波動的相位差有效地減小了它們之間的競爭強度，使它們有可能共存，并形成生物多樣性穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究首次提出了在LDIR環(huán)境下，能夠使微生物群落中的各個物種發(fā)生不同程度的生長延遲，從而產(chǎn)生與維持微生物群落內(nèi)部的物種多樣性觀點。通過實驗觀測確證了這種動力學機制的存在，并根據(jù)計算機數(shù)值仿真實驗結(jié)果，證實了這種機制對產(chǎn)生和維持微生物群落內(nèi)部物種多樣性的有效性。從而為科學認識空間LDIR環(huán)境下微生物群落復雜多樣性的演替過程奠定了理論基礎(chǔ)。