文輝忠 梁英彩 肖程月 邱子情 李娟

摘 要 以荔枝皮為原料制備碳量子點(diǎn)（CQDs），此CQDs具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，可催化H2O2氧化3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，而半胱氨酸（CySH）能還原TMB的氧化產(chǎn)物（ox-TMB）使其褪色?；谏鲜鲈?，建立了以CQDs為類(lèi)過(guò)氧化物酶的CySH測(cè)定方法。以TMB為底物，考察了pH值和溫度等因素對(duì)CQDs催化性能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TMB濃度為0.25 mmol/L時(shí)，在pH=3.5、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間10 min、 0.5 mmol/L H2O2及 0.5 μg/mL CQDs等條件下，體系吸光度的減少值（ΔA）與半胱氨酸濃度在0.05～4.00 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為0.02 μmol/L（3σ/k）。血清中的常見(jiàn)氨基酸不干擾測(cè)定，實(shí)際血清樣品中半胱氨酸的加標(biāo)回收率為94.0%～104.0%。

關(guān)鍵詞 碳量子點(diǎn); 模擬酶; 半胱氨酸

1 引 言

半胱氨酸（CySH）是組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸中唯一具有巰基的氨基酸，它是生物體內(nèi)的還原劑，參與蛋白質(zhì)和谷胱甘肽的合成，具有保護(hù)細(xì)胞免受毒物損害等功能，是與疾病相關(guān)的一種重要的生理調(diào)節(jié)因子[1～3]。因此，對(duì)半胱氨酸含量進(jìn)行分析測(cè)定具有重要意義。目前，有關(guān)半胱氨酸含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、熒光法[7]及電化學(xué)法[8]]等。這些方法具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但需要昂貴的儀器或冗長(zhǎng)的樣品預(yù)處理、復(fù)雜的操作過(guò)程。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的半胱氨酸測(cè)定方法很有必要。近年來(lái)，隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，納米材料在分析測(cè)定中的應(yīng)用日益廣泛。基于金或銀納米粒子團(tuán)聚后發(fā)生顏色變化的光度分析法已應(yīng)用于半胱氨酸的定量測(cè)定[9，10]。研究表明，貴金屬納米顆?；蚪饘傺趸锛{米顆粒具有類(lèi)過(guò)氧化物酶特性，可催化H2O2氧化3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生顯色反應(yīng); 而半胱氨酸分子結(jié)構(gòu)中含有巰基，具有較強(qiáng)的還原性，能還原TMB的氧化產(chǎn)物（ox-TMB）使其褪色，從而引起吸光度降低[11]?；谏鲜鲈恚芯空唛_(kāi)發(fā)了以金納米簇[12]、Fe3O4納米纖維[13]及NiO納米花[14]等為類(lèi)過(guò)氧化物酶的半胱氨酸測(cè)定新方法。

碳量子點(diǎn)（CQDs）是一種新型納米材料，具有成本低、熒光發(fā)射強(qiáng)度高、毒性低及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)分析[15， 16]和生物傳感[17， 18]等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。2011年，Shi等[19]發(fā)現(xiàn)從蠟燭煙灰制備的CQDs具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，可催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng)，開(kāi)創(chuàng)了CQDs應(yīng)用于H2O2及葡萄糖測(cè)定研究的新領(lǐng)域。近年來(lái)，類(lèi)似研究屢見(jiàn)報(bào)道，如Lin等[20]制備氮摻雜的CQDs用于H2O2及葡萄糖的測(cè)定; Wang等[21] 以鴨血為原料，制備多元素?fù)诫s的CQDs用于葡萄糖的比色測(cè)定。本研究以荔枝皮為原料制備CQDs，此CQDs具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，可催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng); 而半胱氨酸能還原TMB的氧化產(chǎn)物（ox-TMB）使其褪色[11]。基于上述原理，發(fā)展一種以CQDs為類(lèi)過(guò)氧化物酶的半胱氨酸測(cè)定方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品分析。與其它來(lái)源的類(lèi)過(guò)氧化物酶相比，以丟棄的荔枝皮為原料制備的CQDs類(lèi)過(guò)氧化物酶具有成本低、催化活性強(qiáng)和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-4802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海龍尼柯儀器有限公司）; H1850離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）; DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）; Nicolet iS5傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）; RF-5301型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）;? Tecnai G2 F20 S-Twin透射電鏡 （美國(guó)FEI 公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 CQDs的制備 將洗凈烘干后的荔枝皮置于坩堝中，用電爐碳化后磨碎; 粉末用丙酮洗滌3次，干燥后，得碳粉。CQDs的制備參照文獻(xiàn)[22]方法并略有改動(dòng)：稱(chēng)取0.5 g干燥碳粉，加入到150 mL 5 mol/L HNO3溶液中， 在140℃下回流12 h; 然后，用Na2CO3溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，在去離子水中透析2天。在透析后的溶液中加入丙酮，在16000 r/min下離心15 min; 棄去上清液，固體沉淀在真空干燥箱中干燥，準(zhǔn)確稱(chēng)重，分散于去離子水中，用離心超濾管超濾除去大顆粒，得棕色CQDs溶液; 最后，用去離子水稀釋得到50 μg/mL CQDs溶液，于4℃保存， 備用。

2.2.2 半胱氨酸的測(cè)定 在10 mL比色管中，依次加入0.5 mL 5.0 mmol/L TMB、1.0 mL 5.0 mmol/L H2O2、0.1 mL 50 μg/mL CQDs、1.0 mL CySH溶液，充分混合，用0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液（pH=3.5）定容至 10 mL， 在40℃水浴中反應(yīng)10 min，測(cè)定吸收光譜，記錄652 nm處的吸光度值（A）。同樣條件下做不加CySH的試劑空白（A0）實(shí)驗(yàn)，計(jì)算吸光度差ΔA=A0- A。

3 結(jié)果與討論

3.1 CQDs的表征

由CQDs的透射電鏡圖（圖1A）可見(jiàn)，制備的CQDs分散性好，顆粒呈球狀，粒度分布均勻，主要分布在2～5 nm范圍內(nèi)，平均直徑為3.1 nm。圖1B中， 0.21 nm的晶格間距與石墨的（100）晶面相符[23]。圖1C是不同激發(fā)波長(zhǎng)下CQDs的熒光發(fā)射光譜，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從360 nm逐漸增加到500 nm時(shí)，CQDs的熒光發(fā)射峰從470 nm紅移至550 nm，呈現(xiàn)明顯的激發(fā)依賴(lài)的熒光特性，與文獻(xiàn)[24，25]報(bào)道的結(jié)果一致。圖1D為CQDs的紅外光譜圖， 3367和1396 cm1處分別出現(xiàn)OH的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)峰，1130和1608 cm1處分別出現(xiàn)CO和CO的伸縮振動(dòng)峰[26]， 表明CQDs表面含有親水基團(tuán)OH和COOH， 保證了CQDs良好的水溶性。

3.2 CQDs的催化活性及CySH的測(cè)定原理

在pH=3.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，以TMB為顯色底物，考察了CQDs的催化活性及CySH對(duì)顯色反應(yīng)的影響。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)溶液中只有H2O2和TMB 存在時(shí)，溶液顏色接近無(wú)色，對(duì)應(yīng)的吸收光譜在652 nm 處有一個(gè)弱吸收峰（圖2a），說(shuō)明H2O2能使TMB發(fā)生微弱的顯色反應(yīng); 當(dāng)H2O2和TMB混合溶液中存在CQDs時(shí)，體系顏色為深藍(lán)色，對(duì)應(yīng)的吸收光譜在652 nm處有氧化態(tài)TMB （ox-TMB）的特征吸收峰（圖2b），說(shuō)明所制備的CQDs具有類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化特性，能夠催化H2O2 氧化TMB 產(chǎn)生顯色反應(yīng)。其原因可能是CQDs表面帶負(fù)電荷，而TMB在pH=3.5的酸性介質(zhì)中帶正電，可通過(guò)靜電作用吸附于CQDs表面。由于CQDs良好的電子轉(zhuǎn)移能力，TMB氨基上的孤對(duì)電子可通過(guò)CQDs轉(zhuǎn)移給H2O2，即CQDs可以加速電子供體TMB 與電子受體H2O2之間的電子轉(zhuǎn)移，提高H2O2的分解速率[27]。在H2O2、TMB和CQDs混合溶液中加入CySH后，體系顏色變淺，652 nm處的特征峰吸收波長(zhǎng)不變，但吸收強(qiáng)度降低（圖2c），這是因?yàn)镃ySH具有較強(qiáng)的還原性，能還原ox-TMB使其褪色[11]。進(jìn)一步研究表明，652 nm處的吸光度隨CySH濃度的升高而降低（圖2d）。據(jù)此可建立一種通過(guò)吸光度變化（ΔA=A0- A）測(cè)定CySH濃度的分析方法。

3.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

考察了溶液的pH值、反應(yīng)溫度等條件對(duì)CQDs 類(lèi)過(guò)氧化物酶催化活性的影響，并對(duì)反應(yīng)時(shí)間及H2O2的濃度進(jìn)行了優(yōu)化（圖3）。H2O2氧化TMB的顯色反應(yīng)都是在酸性條件下進(jìn)行[28～31]，因此首先考察了不同pH值的酸性緩沖溶液（HAc-NaAc）對(duì)反應(yīng)體系ΔA值的影響（圖3A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CQDs類(lèi)過(guò)氧化物酶活性的最適酸度為pH=3.5。反應(yīng)溫度對(duì)CQDs催化活性的影響見(jiàn)圖3B， 40℃時(shí)CQDs的催化活性最高。如圖3C所示，在40℃的水浴中反應(yīng)8 min后，ΔA趨于穩(wěn)定，因此選擇混合反應(yīng)10 min后測(cè)定體系的吸收值。由圖3D可見(jiàn)，H2O2濃度在0.5～0.6 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，ΔA值大且穩(wěn)定，因此選擇H2O2的濃度為0.5 mmol/L。

3.4 方法的分析性能及樣品分析

當(dāng)CySH的濃度為3.0 μmol/L時(shí)，分別考察了濃度均為30 μmol/L的甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、賴(lài)氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）等常見(jiàn)氨基酸對(duì)分析結(jié)果的影響。因其它氨基酸分子中不含巰基，不能將ox-TMB還原，對(duì)分析結(jié)果幾乎沒(méi)有影響（圖4），說(shuō)明本方法檢測(cè)CySH的選擇性良好。

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定不同濃度CySH存在時(shí)體系的響應(yīng)信號(hào)。由圖5可見(jiàn)，隨著CySH濃度的增加，體系在652 nm 處ox-TMB的特征吸收峰波長(zhǎng)不變，吸收強(qiáng)度逐漸減弱; 當(dāng)CySH濃度在0.05～4.00 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，與ΔA呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為ΔA=0.1569C （μmol/L） + 0.051，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，方法檢出限（3σ/k）為0.02 μmol/L。表1列出了以不同材料為類(lèi)過(guò)氧化物酶的半胱氨酸檢測(cè)方法的分析性能，可見(jiàn)本方法的檢出限較低，線(xiàn)

4 結(jié) 論

以荔枝皮為原料制備了CQDs， 基于CQDs的類(lèi)過(guò)氧化物酶特性，可催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng)及CySH能還原TMB的氧化產(chǎn)物（ox-TMB）使其褪色的原理，建立了一種以CQDs為類(lèi)過(guò)氧化物酶的CySH測(cè)定方法。本方法選擇性好，靈敏度高，應(yīng)用于血清中CySH的測(cè)定，效果良好。本研究不僅為具有催化活性的CQDs的制備提供了一種有效方案，也為進(jìn)一步拓展CQDs的應(yīng)用提供了新思路。

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