賈全全,龔 斌,李康琴,夏詩(shī)琪,鄧紹勇,胡小紅,朱培林

江西省林業(yè)科學(xué)院,南昌 330032

泡桐(Paulowniafortunei)是我國(guó)特有的速生闊葉樹(shù)種,栽培歷史悠久,是重要的用材和綠化樹(shù)種。泡桐生長(zhǎng)速度快,輪伐周期短,對(duì)土壤養(yǎng)分消耗過(guò)大,導(dǎo)致林地質(zhì)量下降,嚴(yán)重影響了泡桐林地的生態(tài)效益[1]。研究表明,農(nóng)桐間作能夠有效的改善林地土壤質(zhì)量,同時(shí)提高經(jīng)濟(jì)效益[2]。目前對(duì)泡桐林間作模式的研究多集中在產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分方面,對(duì)間作模式下叢枝真菌方面的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道[3- 4]。早在20世紀(jì)80年代我國(guó)就開(kāi)始對(duì)泡桐組培苗進(jìn)行人工接種叢枝真菌,接種后可以大大縮短緩苗期,提高幼苗的抵抗力,是培育泡桐壯苗的重要措施之一[5]。但叢枝真菌在泡桐生長(zhǎng)后期所發(fā)揮的功能及產(chǎn)生的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizae fungi,AMF)是一類在土壤中廣泛存在的功能微生物,能與絕大多數(shù)陸地植物共生形成叢枝菌根[6- 7]。叢枝菌根能夠提高植物對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率,增強(qiáng)植物的耐旱和抗逆能力[8- 10]。此外,AMF能在植物根際形成龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),具有改善土壤生態(tài)環(huán)境的作用,能有效地緩解連作障礙,提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)[11]。雖然AMF與植物的共生無(wú)專一性,但由于植物生理代謝、根系形態(tài)結(jié)構(gòu)以及分泌物等方面的差異,AMF對(duì)宿主植物的侵染也會(huì)具有選擇性[12],且間作后土壤環(huán)境的改變對(duì)菌根的形成和效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生影響[13- 14]。而AMF群落組成是其功能的基礎(chǔ),為此,本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),在江西鄱陽(yáng)湖周邊平原崗地研究泡桐-玉竹(Polygonatumodoratum)、泡桐-麥冬(Ophiopogonjaponicus)和泡桐-射干(Belamcandachinensis)3種常見(jiàn)的桐-藥復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式對(duì)泡桐AMF群落組成的影響,以期為研究桐-藥復(fù)合模式下泡桐AMF的功能及其對(duì)泡桐生長(zhǎng)后期和土壤環(huán)境產(chǎn)生的作用方面提供理論支持。

1 材料方法

1.1 研究地概況

采樣地點(diǎn)位于江西省共青城市江益鎮(zhèn)躍進(jìn)村泡桐種植基地(29°11′8.97″N,115°47′20.47″E),該地屬亞熱帶季風(fēng)氣候,四季分明,雨量充沛,年平均降雨量為1350—1710 mm,日照時(shí)數(shù)為2000 h,無(wú)霜期約200 d。泡桐林于2009年用1年生根繁苗造林,株行距4 m×6 m,2014年間伐后株行距為8 m×6 m,2015年4月林下行間間作中藥材麥冬和射干,2018年1月間作玉竹。

1.2 根系樣品采集

2018年5月,分別在泡桐純林、泡桐-玉竹、泡桐-麥冬和泡桐-射干復(fù)合種植地設(shè)立實(shí)驗(yàn)樣地,每種樣地間隔16 m。林分平均胸徑29.3 cm,平均樹(shù)高15.6 m。林地土壤信息詳見(jiàn)表1。中藥材根系采用全挖法獲得,泡桐根系采用挖土塊法,每個(gè)樣地隨機(jī)選3—5株,在距樹(shù)干1—2 m處,用鐵鏟挖取3—5個(gè)體積30 cm×30 cm×20 cm大小的土塊,從與主根相連的側(cè)根上判斷泡桐根系的特征,將采集的泡桐細(xì)根樣品裝入封口袋后置于冷藏箱中。帶回實(shí)驗(yàn)室后,挑選10—20條具有1—2級(jí)根的根枝放入裝有酒精濃度50%的塑料瓶中,用于菌根侵染率的測(cè)定;挑選50條左右?guī)в?級(jí)根的根枝,洗凈后放入硅膠中,用于AMF多樣性檢測(cè)。

表1 泡桐林地土壤養(yǎng)分情況

1.3 AMF侵染率測(cè)定

采用堿解離-乳酸墨水染色法對(duì)根系樣品進(jìn)行染色[15]。從染色完成的根段中隨機(jī)挑選10個(gè)根段制片,在顯微鏡下觀測(cè)菌根侵染情況,每個(gè)樣品觀測(cè)不少于300個(gè)視野。依據(jù)McGonigle等[16]方法計(jì)算菌根侵染率,并按照菌根侵染率將侵染等級(jí)分為5級(jí)：0—5%為1級(jí);6%—25%為2級(jí);26%—50%為3級(jí);51%—75%為4級(jí);76%—100%為5級(jí)。

1.4 根內(nèi)AMF分子多樣性測(cè)定

1.4.1DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.A.? soil試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA提取,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè),利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量;用AMV4- 5NF(5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG- 3′)和AMDGR(5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT- 3′)引物對(duì)叢枝真菌18S rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17],擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min,32個(gè)循環(huán)(95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s),最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL,4 μL 5*FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL Forward Primer(5 μmol/L),0.8 μL Reverse Primer(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶,2 μL BSA,10ng DNA模板。

1.4.2Illumina Miseq測(cè)序數(shù)據(jù)處理

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。使用UPARSE 7.1軟件,根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)聚類,并在聚類的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,參考MaarjAM叢枝真菌數(shù)據(jù)庫(kù),得到具有豐度和物種信息的OTU表用于后續(xù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan法分析不同樣品侵染率差異是否顯著(α=0.05)。并利用I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行Alpha多樣性分析。文中作圖由Microsoft Excel 2010和I-Sanger云平臺(tái)完成。

2 結(jié)果

2.1 菌根侵染率

在不同經(jīng)營(yíng)模式下泡桐菌根侵染率存在較大差異,其中泡桐-射干復(fù)合模式(PB)下泡桐菌根侵染率最低(19.33%),其次是泡桐-麥冬復(fù)合模式(PO),二者與泡桐純林(PCK)的菌根侵染率存在顯著差異(P<0.05);而PCK和泡桐-玉竹復(fù)合模式(PP)的泡桐菌根率差異不顯著(P>0.05),且侵染程度較高,侵染等級(jí)均為4級(jí),PO、PB的泡桐菌根侵染等級(jí)分別為3級(jí)和2級(jí)(圖1)。林下中藥材玉竹的菌根侵染率為0,中藥材射干和麥冬菌根侵染率分別為2級(jí)和1級(jí)(圖1)。

圖1 不同樣地類型物種的叢枝菌根真菌侵染率Fig.1 Arbuscular mycorrhizal infection rate of different species in different plotsPCK代表泡桐純林,PP代表泡桐-玉竹林,PB代表泡桐-射干林,PO代表泡桐-麥冬林;不同小寫(xiě)字母表示不同樣地泡桐菌根侵染率差異顯著(P<0.05);誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差

圖2 不同樣地類型的泡桐獨(dú)有和共有OTU數(shù) Fig.2 The unique and common OTU numbers of Paulownia fortunei from different plotsPCK代表泡桐純林中泡桐,PP代表泡桐-玉竹林中泡桐,PB代表泡桐-射干林中泡桐,PO代表泡桐-麥冬林中泡桐

2.2 測(cè)序結(jié)果

對(duì)4類泡桐根系樣品(PCK、PP、PB和PO模式下的泡桐菌根)進(jìn)行高通量測(cè)序,共獲得159183條有效的高質(zhì)量序列,采用97%的相似性聚類分析,共獲得46條AMF的OTU。在PCK、PP、PB和PO等4種樣地類型中,泡桐分別有34、26、24和20條OTUs。此外,每種樣地類型中泡桐都有其獨(dú)有的OTUs,且泡桐純林中,獨(dú)有的OTUs(6條)和OTUs總數(shù)最多(圖2)。

2.3 Alpha多樣性分析

所有樣地的泡桐菌根真菌群落覆蓋率均為100%;除PO的泡桐Ace指數(shù)(物種豐富度)最高以外,與PCK相比,3種桐-藥復(fù)合樣地的泡桐菌根真菌的Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)(物種多樣性)均有所降低,其中PP和PO的泡桐Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)略高于PB;而PCK的Shannoneven指數(shù)(物種均勻度)最低(表2)。

2.4 AMF群落結(jié)構(gòu)分析

在不同經(jīng)營(yíng)模式的樣地中,泡桐AMF群落主要由球囊霉科(Glomeracea)、巨孢囊霉科(Gigasporaceae)、無(wú)梗囊霉科(Acaulosporaceae)和多孢囊霉科(Diversisporaceae)組成(圖3)。其中球囊霉科的豐度最大,除PO外(相對(duì)豐度為73.97%),其他類型樣地泡桐的球囊霉科相對(duì)豐度均在90%以上(圖3)。除PP的泡桐外,其他物種的AMF群落都存在巨孢囊霉科真菌,但豐度差異較大,其中PO中泡桐的巨孢囊霉科AMF豐度最大(18.13%),其次為中藥材射干和麥冬,另外兩種樣地泡桐的巨孢囊霉科AMF豐度均小于1%。除麥冬外,其他五個(gè)物種均含有無(wú)梗囊霉科AMF。只有PB的泡桐含有多孢囊霉科AMF,且相對(duì)豐度為2.73%(圖3)。

表2 不同樣地類型的泡桐叢枝菌根真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

圖3 不同樣地類型物種的AMF科的相對(duì)豐度 Fig.3 Relative abundance of abuscular mycorrhizal fungal families of different species in different plotsPCK代表泡桐純林中泡桐,PP代表泡桐-玉竹林中泡桐,PB代表泡桐-射干林中泡桐,PO代表泡桐-麥冬林中泡桐,Bel代表射干,Oph代表麥冬

3 討論

泡桐是AMF共生樹(shù)種,其組培苗接種球囊霉科真菌可以顯著提高其對(duì)養(yǎng)分的吸收效率[7]。本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),測(cè)定了泡桐純林、泡桐-玉竹林、泡桐-麥冬林和泡桐-射干林不同經(jīng)營(yíng)模式下泡桐AMF的群落組成,從中獲得了46個(gè)可操作分類單元,分屬于4個(gè)科(圖3)。吳鐵航等[18]調(diào)查發(fā)現(xiàn),球囊霉科是江西紅壤地區(qū)林地和耕地土壤中最常見(jiàn)的叢枝真菌類型,這與我們調(diào)查的泡桐樣地的優(yōu)勢(shì)科結(jié)果一致。同時(shí),也說(shuō)明這些球囊霉科AMF與泡桐具有極強(qiáng)的親和性,這為篩選泡桐高效共生AMF菌種提供了依據(jù)。

AMF作為聯(lián)系宿主植物根系與土壤環(huán)境之間的橋梁,其分布必然受到宿主植物和根際土壤環(huán)境的直接影響[19]。研究結(jié)果顯示,泡桐-麥冬和泡桐-射干林的泡桐菌根侵染率顯著低于泡桐純林(圖1),這可能與間作中藥材后土壤的理化性質(zhì)的改變有關(guān)[20],也可能是中藥材根系及其AMF產(chǎn)生的分泌物影響了泡桐根系A(chǔ)MF的侵染能力[12]。然而,泡桐-玉竹復(fù)合模式的泡桐菌根侵染率與純林差異并不顯著,這可能與玉竹間作的時(shí)間較短有關(guān)。多年生玉竹菌根侵染率可達(dá)60%以上[21],但由于本研究樣地中玉竹的間作時(shí)間較短,還沒(méi)有AMF侵染,因此對(duì)泡桐根系的AMF也沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。所以,推測(cè)泡桐林內(nèi)長(zhǎng)期間作中藥材會(huì)影響AMF對(duì)泡桐根系的侵染水平。

在本研究中,泡桐-玉竹和泡桐-射干林中泡桐AMF的物種豐富度、多樣性和均勻度均低于純林(圖1,表2),且泡桐純林中,獨(dú)有的OTUs和OTUs總數(shù)最多(圖2),但在泡桐-麥冬樣地中,泡桐AMF的物種多樣性和均勻度略高于純林,這可能是由于泡桐-麥冬樣地中泡桐的AMF中巨孢囊霉科和無(wú)梗囊霉科的相對(duì)豐度較高,而優(yōu)勢(shì)科球囊霉科的相對(duì)豐度明顯低于其他模式,造成了群落結(jié)構(gòu)格局的變化。泡桐-麥冬林中泡桐AMF中巨孢霉囊科的相對(duì)豐度高達(dá)18.13%,這可能與中藥材麥冬根系中巨孢霉囊科相對(duì)豐度較高有關(guān)。所以泡桐林下間作中藥材,會(huì)因間作的物種不同而影響AMF對(duì)泡桐的侵染能力,也就是說(shuō),植物群落的物種多樣性改變及群落內(nèi)種間的相互作用,會(huì)對(duì)不同物種的AMF群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度地影響[22]。

另外,在所有調(diào)查的泡桐樣地中,只有泡桐-射干林中的泡桐AMF中含有多孢囊霉科真菌(圖3),在射干根系中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多孢囊霉科真菌,而且多孢囊霉科并不是紅壤地區(qū)常見(jiàn)的真菌類型,因此,多孢囊霉科真菌出現(xiàn)的原因及其對(duì)泡桐生長(zhǎng)的影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

AMF是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的微生物資源之一,本研究通過(guò)對(duì)泡桐純林、泡桐-玉竹林、泡桐-麥冬林和泡桐-射干林中泡桐AMF群落特征的研究發(fā)現(xiàn),桐-藥間作模式會(huì)降低泡桐根系A(chǔ)MF的侵染率,改變其群落結(jié)構(gòu)組成,但這些群落結(jié)構(gòu)的差異是否影響了其生態(tài)功能目前尚不明確,另外,不同復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式下AMF群落結(jié)構(gòu)的差異,對(duì)泡桐的生長(zhǎng)以及保持土壤健康與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)方面的影響還有待進(jìn)一步研究。