趙安琪，王興華，謝 偉，張 芳，王曉晴，孟 緣

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

我國(guó)是世界上較大的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，豬肉加工生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的大量豬皮因消化率低、加工不便、清洗不易等不利因素難以應(yīng)用于衣食領(lǐng)域，導(dǎo)致資源浪費(fèi)、環(huán)境污染。因此，開(kāi)發(fā)利用豬皮是我國(guó)利用豬皮下腳料的主要方向之一[1]。并且豬皮膠原蛋白水解產(chǎn)物中含有具有生物活性的肽，其作用包括降低膽固醇[2]、抗氧化[2-3]、促創(chuàng)傷愈合[4]、降血壓[5-6]、抗菌[7]等。膠原蛋白活性肽主要通過(guò)體外消化膠原蛋白獲得，其中酶解法優(yōu)點(diǎn)最多，應(yīng)用最廣，而文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白質(zhì)酶解過(guò)程多采用堿性蛋白酶[8]，故本文所選用的單酶即為堿性蛋白酶。

然而，目前關(guān)于豬皮酶法提取的研究報(bào)道不少，但大多側(cè)重于酶解條件工藝篩選的研究，對(duì)酶解前前處理的相關(guān)研究較少，且豬皮脂肪組織發(fā)達(dá)，油脂的脫除是一大難題[9]。超聲波是頻率大于20kHZ的聲波，它是一種波動(dòng)形式，同時(shí)又是一種能量形式，可用于影響、改變以至破壞媒質(zhì)的狀態(tài)、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)[10]，作為一種能量形式，超聲波可破壞組織細(xì)胞[11-14]，張玲[15]等研究表明，超聲能有效提高豬皮脫脂率，據(jù)此猜想超聲在豬皮酶解工藝中對(duì)其產(chǎn)物的抗氧化活性亦有改善，特立此題研究。

本研究以豬皮為原料，用Na2CO3對(duì)其進(jìn)行脫脂后，利用單因素試驗(yàn)，以ABTS自由基清除率為指標(biāo)，確定酶解提取膠原蛋白抗氧化肽的最佳時(shí)間、溫度、PH和酶用量，在最佳條件下，研究超聲前處理時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物清除ABTS自由基效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮：市售；堿性蛋白酶：食品級(jí)，陜西森弗天然制品有限公司，酶活力≥10萬(wàn)U/g;10%鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液、濃硫酸。試劑為分析純，水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；DV251C電子天平：OHAuS;AB135-S十萬(wàn)分之一型天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司； PHS-3CPH計(jì)：上海雷磁儀器廠；PK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱爐；離心機(jī)；L3S紫外分光光度計(jì) ：上海儀電分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 脫脂

將新鮮豬皮去毛，刮除表皮脂肪，水漂洗三次，將豬皮切成5mm×5mm方形小塊，稱取一定量的剪碎的豬皮置于圓底燒瓶中，取備用豬皮四份，每份約 50g，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加8倍量[16]2%碳酸鈉溶液，40℃脫脂(60r/min)4h，水洗至中性，得到脫脂豬皮。

1.3.2 酶解

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考敖冉[17]等對(duì)酶解工藝的優(yōu)選研究，將豬皮酶解單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件定為：底物濃度為6%，酶與底物濃度比2.5%，酶解pH值=8，酶解時(shí)間4h,酶解溫度50℃。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分析酶與底物濃度比、酶解PH、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)酶解效果的影響。各因素梯度分別為：酶與底物濃度比：2%、2.5%、3%、3.5%、4%；酶解pH：6、7、8、9、10；酶解時(shí)間：3h、3.5h、4h、4.5h、5h；酶解溫度：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。

1.3.2.1 酶與底物濃度比因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值=8，在50 ℃、轉(zhuǎn)速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶,保溫4 h的酶解條件下，考察加酶量分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%時(shí)酶解得到的產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率。清除率結(jié)果圖 1。

1.3.2.2 酶解pH值因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，在50 ℃、轉(zhuǎn)速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%,保溫4 h的酶解條件下，考察酶解pH值分別為6、7、8、9、10時(shí)酶解得到的產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率。清除率結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.3.2.3 酶解時(shí)間因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值=8，在50 ℃、轉(zhuǎn)速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%的酶解條件下，考察酶解時(shí)間分別為3h、3.5h、4h、4.5h、5h時(shí)酶解得到的產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率。清除率結(jié)果見(jiàn)圖 3。

1.3.2.4 酶解溫度因素的研究

取脫脂豬皮，用10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值=8，在轉(zhuǎn)速45～50 r/min、加入堿性蛋白酶量為2.5%,保溫4 h的酶解條件下，考察酶解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃時(shí)酶解得到的產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率。清除率結(jié)果見(jiàn)圖 4。

在各單因素條件下酶解后，分別取出于電熱爐上煮沸10min滅酶，冷卻，4500r的轉(zhuǎn)速離心5min，抽濾，上清液定容至250mL，取100mL于錐形瓶中，得5份待測(cè)溶液。

每個(gè)因素重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 超聲前處理

對(duì)豬皮進(jìn)行酶解前的超聲處理，設(shè)置處理時(shí)間分別為0min、10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min。然后在堿性蛋白酶的最適條件(酶與底物濃度比2.5%，酶解溫度50℃，pH值=8，酶解時(shí)間4h)下對(duì)超聲處理的豬皮分別進(jìn)行酶解，檢測(cè)其酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 ABTS自由基清除法原理

用 K2S2O8與 ABTS 直接生成穩(wěn)定的陽(yáng)離子自由基 ABTS+，抗氧化物質(zhì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。

1.3.4.2 ABTS工作液的制備

ABTS儲(chǔ)備液(7.4 mmol/L)的制備：取ABTS 96 mg，加蒸餾水25 mL。

K2S2O8儲(chǔ)備液(2.6 mmol/L)的制備：取K2S2O8378.4 mg，加蒸餾水10 mL。

將5 mL 7.4 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液與88 μL 2.6 mmoL/L K2S2O8混勻，靜置12～16h，配制成ABTS工作液。

1.3.4.3 PBS緩沖液的制備

稱取氯化鈉7.9g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，磷酸氫二鈉1.8g，溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容到1L。保存于4℃冰箱中。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率測(cè)定

取0.4 mL ABTS工作液，用pH值為7.4的 PBS 溶液稀釋，要求用紫外分光光度計(jì)測(cè)得其在常溫下734nm 處吸光值為 0.7±0.02。取稀釋后的ABTS+·工作液0.2 mL 與 10μL 不同條件受試物混合，常溫避光靜置 6min，在 734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，平行3次。

ABTS自由基清除能力由下式計(jì)算：

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100%

式中： A0為不加樣品，加入 ABTS 的吸光度；Ai為加入樣品和 ABTS 的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解豬皮單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶與底物濃度比對(duì)清除率的影響

由圖 1可知，酶與底物濃度比為2.5%時(shí)，清除率最高達(dá)88%左右，隨著酶與底物濃度比的進(jìn)一步增加，清除率總體呈緩慢下降趨勢(shì)，綜合考慮清除率和經(jīng)濟(jì)因素，酶與底物濃度比以2.5%左右為宜。

圖1 堿性蛋白酶在不同酶濃度時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率

2.1.2 酶解pH值對(duì)清除率的影響

由圖2可知，堿性蛋白酶酶解豬皮存在最適pH值=8，此時(shí)清除率最高達(dá)81%左右。

圖2 堿性蛋白酶在不同酶解PH時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)清除率的影響

由圖3可知，堿性蛋白酶在酶解時(shí)間為4h時(shí)，清除率達(dá)到最大值后開(kāi)始趨于平緩，繼續(xù)加熱意義不大，此時(shí)的清除率是83%。

圖3 堿性蛋白酶在不同酶解時(shí)間時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率

2.1.4 酶解溫度對(duì)清除率的影響

由圖4可知，性蛋白酶在酶解溫度為50℃時(shí)清除率最大為82.4%，繼續(xù)升溫清除率值呈直線下降。

圖4 堿性蛋白酶在不同酶解溫度時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率

2.2 超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)清除率的影響

由圖5可知，超聲預(yù)處理豬皮可整體提高清除率，并且超聲50min時(shí)清除效果最好，清除率為88.9%。

圖5 堿性蛋白酶在不同超聲預(yù)處理時(shí)間時(shí)的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率

3 結(jié)論

堿性蛋白酶水解豬皮的產(chǎn)物具有抗氧化性，堿性蛋白酶酶解豬皮的最適條件：酶與底物濃度比2.5%、酶解pH值=8、酶解時(shí)間4h、酶解溫度50℃，此時(shí)ABTS+·清除率79.8%。這與余霞[18]等、張榮華[19]等人的研究結(jié)果相一致。

超聲預(yù)處理對(duì)豬皮的酶解效果明顯優(yōu)于未超聲的效果。其中超聲時(shí)間為50min時(shí)酶解效果最好，其自由基清除率可達(dá)88.9%。