張 茹，閆婧璇，劉 玥，于樂(lè)海，李美星，常雪菡，鄭志娟

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

銀翹散出自清·吳瑭的《溫病條辨》，由金銀花一兩、連翹一兩、苦桔梗六錢、薄荷六錢、竹葉四錢、甘草五錢、荊芥穗四錢、淡豆豉五錢、牛蒡子六錢，蘆根六錢[1]組成，該方具有清熱解毒的功效?；舯艿热薣2-4]認(rèn)為煮沸后3min對(duì)外周血T細(xì)胞亞群影響作用較強(qiáng)，3～6min銀翹散對(duì)甲型流感病毒療效最佳。故通過(guò)對(duì)銀翹散煮沸后0～6min的HPLC譜圖及小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞體外增殖情況探討銀翹散的最佳煎煮時(shí)間。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

LC-10ATvp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)；超凈臺(tái)；MemmentCO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)等。

1.2 藥材

金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、苦桔梗、蘆根、淡豆豉、生甘草、竹葉、荊芥穗，購(gòu)于安國(guó)市久旺藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑

對(duì)照品綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷均為分析純購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，環(huán)磷酰胺(CY)，甲醇(色譜純)，磷酸，脂多糖(LPS)，刀豆蛋白(ConA)，噻唑藍(lán)(MTT)， RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清。

1.4 其他材料

SPF級(jí)小鼠，雌性，體重18～22g。

2 方法

2.1 色譜

2.1.1 色譜條件

Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)，流動(dòng)相甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)梯度洗脫(0～1min，1%～2%A;10.01～30min，2%～15%A;30.01～50min，15%～20%A;50.01～80min， 20%～40%A;80.01～100min，40%～43%A)，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃。

2.1.2 供試品溶液制備

將上述十種藥品打粉，按照比例(水與總藥量比例為5∶1)提前浸泡1h,然后進(jìn)行煎煮，煮沸時(shí)間分別為0、1.5、3、4.5、6min。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品，綠原酸0.0038g，連翹苷0.0046g，牛蒡子苷0.0064g，用甲醇定容。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 小鼠前期準(zhǔn)備

小鼠連續(xù)15天注射環(huán)磷酰胺(60mg/kg×bw)。

2.2.2 制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞

第16天將小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3～5min,在超凈臺(tái)內(nèi)分離脾臟，放在盛有適量PBS的培養(yǎng)皿中，剝離脂肪與筋膜組織，置于200目篩網(wǎng)用無(wú)菌注射針針芯輕輕研磨，收集細(xì)胞懸液，加入Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞，靜置5min，800r/min離心10min[5]，棄上清。收集細(xì)胞懸液，稀釋成(2.0×106)mL，備用。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

RPMI 1640完全培養(yǎng)液即為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基[6]。

空白對(duì)照組：完全培養(yǎng)液；LPS對(duì)照組：完全培養(yǎng)液+10μg/mL LPS；ConA對(duì)照組組：完全培養(yǎng)液+10μg/mL ConA；T淋巴細(xì)胞組：ConA+不同煎煮時(shí)間銀翹散；B淋巴細(xì)胞組：LPS+不同煎煮時(shí)間銀翹散

2.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取稀釋好的脾臟細(xì)胞懸液100μL置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)2.2.3實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥，最終每孔體積為200μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔吸棄100μL上清液，加150μ LDMSO,混勻，恒溫振蕩5min，酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)得吸光度值。

3 結(jié)果及討論

3.1 銀翹散及其三種主要成份分析

通過(guò)印酬等人[7]推斷銀翹散中主要起作用的為金銀花、連翹、牛蒡子，故選取其三種藥材的主要成分作為對(duì)照品(綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷)，根據(jù)2.1.3配制的對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)，峰1、2、3分別為綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷。

圖1 三種對(duì)照品HPLC譜圖

圖2 樣品HPLC譜圖

峰號(hào) S0 S1 S2 S3 S4 S5 平均 RSD/%10.494 0.506 0.507 0.506 0.505 0.504 0.504 0.96420.966 0.966 0.966 0.964 0.964 0.967 0.966 0.10431.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000

表2 相對(duì)峰面積

3.2 不同煎煮時(shí)間銀翹散對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖影響

由表3可知，不同煎煮時(shí)間銀翹散與ConA共同影響免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖，在1.5min時(shí)最佳；與LPS共同影響免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖，在3min時(shí)最佳。

表3 不同煎煮時(shí)間銀翹散對(duì)免疫抑制、對(duì)照小鼠脾臟B/T淋巴細(xì)胞增殖的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

4 小結(jié)與討論

銀翹散因其某些成分具有揮發(fā)性，故不能過(guò)度煎煮，把握好煎煮時(shí)間便是關(guān)鍵。與此同時(shí)，劉險(xiǎn)峰[8]認(rèn)為傳統(tǒng)煎煮方法療效較佳，束雅春等人[9]發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)煎煮方法下薄荷、荊芥穗后下煎煮3min、5min效果較好。

本研究通過(guò)對(duì)銀翹散中三種主要成份的HPLC譜圖的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行對(duì)比，可以得出不同煎煮時(shí)間銀翹散中所含成分含量不同；通過(guò)對(duì)免疫抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖可以得出不同煎煮時(shí)間的銀翹散對(duì)脾臟T、B淋巴細(xì)胞體外增殖影響不同。