劉尚雨，鄭黎暉，李波，李巨波，唐躍，姚焰

二尖瓣反流是臨床常見(jiàn)的心臟瓣膜疾病之一，血液在心室收縮期從左心室通過(guò)二尖瓣口反流至左心房，造成左心房負(fù)荷和左心室舒張期負(fù)荷加重，引起左心房、左心室擴(kuò)大，臨床上出現(xiàn)肺淤血和體循環(huán)灌注低下等左心衰竭表現(xiàn)。左心室負(fù)荷增加會(huì)促進(jìn)心肌纖維化，導(dǎo)致左心室順應(yīng)性降低而加重心力衰竭的進(jìn)展和靶器官損傷[1]。硫化氫（H2S）是繼一氧化氮、一氧化碳后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理學(xué)功能[2-4]。在心肌缺血模型中心肌H2S 的合成體系下調(diào)，補(bǔ)充H2S 可保護(hù)心肌的缺血性損傷，而阻斷H2S 生成會(huì)加重?fù)p傷[5-6]。壓力負(fù)荷增加所致的左心功能下降是臨床常見(jiàn)的心力衰竭類型，但因動(dòng)物模型制作困難，目前對(duì)其病理生理機(jī)制研究較少。本研究旨在采用大動(dòng)物水平通過(guò)小切口非體外循環(huán)下二尖瓣腱索拉傷構(gòu)建小型豬二尖瓣反流慢性心力衰竭模型，檢測(cè)心臟功能和結(jié)構(gòu)改變，并探究H2S 體系在慢性心力衰竭中的變化，為臨床對(duì)于壓力負(fù)荷增加所致慢性心力衰竭病理生理機(jī)制和H2S 體系在心力衰竭中的作用提供進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 模型制備

研究選用健康8 個(gè)月齡中華小型豬，術(shù)前體重約30 kg，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)并提供，隨機(jī)分為二尖瓣反流組（n=6）、對(duì)照組（n=6）。采用前期探索的小切口非體外循環(huán)下二尖瓣腱索拉傷造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭動(dòng)物模型[7-8]。動(dòng)物采用氯胺酮和地西泮誘導(dǎo)麻醉，氣管插管，術(shù)中采用異氟醚維持麻醉。于左側(cè)第3 或第4 肋間隙行約4 cm 平行肋間小切口，暴露心包，于左心室側(cè)壁近心尖處縫合荷包，置入自制的“瓣膜損傷器”，回勾住二尖瓣后葉腱索并拉斷，采用心表超聲通過(guò)心尖二腔心切面驗(yàn)證二尖瓣后瓣脫垂造成中至大量反流，退出損傷器后縮窄荷包。對(duì)照組動(dòng)物僅進(jìn)行開(kāi)胸及縫合荷包操作，不損傷二尖瓣。所有動(dòng)物術(shù)后一周給予青霉素3 萬(wàn)單位/d 抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)6 個(gè)月。

1.2 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)

動(dòng)物采用氯胺酮和地西泮誘導(dǎo)麻醉，氣管插管，固定于檢查臺(tái)，超聲心動(dòng)圖采用GE 公司的Vivid7 型彩色多普勒超聲心動(dòng)儀，采集左心房前后徑（LAD）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）等指標(biāo)。LVEF 測(cè)定采用Simpson 雙平面法。二尖瓣反流程度采用反流束面積/左心房面積比值計(jì)算，按照臨床常規(guī)定義比值小于20%為輕度反流、20%～40%為中度反流、大于40%為重度反流。

1.3 在體心功能學(xué)評(píng)價(jià)

動(dòng)物如1.1 所述方法麻醉，記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，穿刺右側(cè)股動(dòng)脈置入導(dǎo)絲，交換為8F 鞘管測(cè)量動(dòng)脈壓力，通過(guò)鞘管置入5F 豬尾導(dǎo)管至左心室測(cè)量左心室壓力。心電與壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，穩(wěn)定后連續(xù)記錄至少15 min 生理參數(shù)。采用儀器分析軟件分析壓力參數(shù)，動(dòng)脈壓分析：平均動(dòng)脈壓、收縮壓、舒張壓；左心室內(nèi)壓分析：左心室收縮末期壓力（LVSP）、左心室舒張期最低壓（LVDP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax）等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物安樂(lè)死，提取左心室組織分別中性福爾馬林固定和液氮速凍-80℃保存。

1.4 術(shù)后6 個(gè)月H2S 和N 末端B 型利鈉肽原（NTproBNP）含量檢測(cè)

采用化學(xué)比色法檢測(cè)H2S 含量，依據(jù)文獻(xiàn)[9]描述方法，將0.1 ml 血漿加入含有0.167%醋酸鋅3.0 ml測(cè)試管中，加入0.5 ml 7.2 mol/L 鹽酸配制的對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶液，再加入0.4 ml 1.2 mol/L 鹽酸配制的三氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)20 min 后加入1 ml 10%三氯乙酸，離心取上清于分光光度計(jì)檢測(cè)665 nm 波長(zhǎng)下吸光度。H2S 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用10 mmol/L 硫氫化鈉溶液梯度稀釋制作。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)NTproBNP 含量，血清樣本使用雙抗夾心法NT-proBNP ELISA 檢測(cè)試劑盒（R&D 公司，美國(guó)），嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀度數(shù)。

1.5 術(shù)后6 個(gè)月心臟重構(gòu)和H2S 體系相關(guān)蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)左心室心肌組織心臟重構(gòu)相關(guān)蛋白Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ），H2S 合成體系胱硫醚-β-合成酶（CBS）；胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）蛋白含量。采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH） 作為內(nèi)部參照，采用灰度值比比較蛋白的含量差異；心肌組織經(jīng)Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 文庫(kù)。采用實(shí)時(shí)定量 PCR 法檢測(cè)心臟重構(gòu)相關(guān)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及H2S 合成體系CBS、CSE mRNA 表達(dá)含量。采用GAPDH 作為內(nèi)部參照，采用比值法比較基因表達(dá)的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，超聲心動(dòng)圖指標(biāo)采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)。雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組與二尖瓣反流組超聲心動(dòng)圖指標(biāo)（表1）：兩組動(dòng)物均在術(shù)前和術(shù)后6 個(gè)月行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，二尖瓣反流組采用反流束面積/左心房面積比值評(píng)價(jià)均為二尖瓣大量反流（57.85±7.09）%。二尖瓣反流組術(shù)后6 個(gè)月LAD 與對(duì)照組比較明顯擴(kuò)大[（4.73±0.28）cm vs （2.67±0.12）cm，P＜0.01]，LVESV[（18.50±2.88） ml vs（10.50±0.99）ml，P ＜0.05] 和 LVEDV[（87.50±12.12） ml vs （42.33±2.04 ） ml，P＜0.01] 明 顯 增 加， 但LVEF[（78.67±1.87）% vs （75.33±1.87）%，P＞0.05]和LVFS[（52.50±1.73）% vs （46.67±2.86）%，P＞0.05]無(wú)明顯變化。

表1 對(duì)照組與二尖瓣反流組超聲心動(dòng)圖指標(biāo)（±s）

二尖瓣反流組與對(duì)照組術(shù)后6 個(gè)月血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與血流動(dòng)力學(xué)左心室壓力-時(shí)間曲線（表2、圖1）：取材前經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，二尖瓣反流組與對(duì)照組比較，股動(dòng)脈平均壓[（83.79±3.81） mmHg vs（88.40±3.48） mmHg，P＜0.01]明顯降低；動(dòng)脈收 縮 壓[（69.84±4.41） mmHg vs （108.70±3.82）mmHg，P＜0.01]和舒張壓[（54.63±2.44） mmHg vs（69.73±2.37） mmHg，P＜0.05]也明顯降低；左心室功能LVSP[（86.66±5.60） mmHg vs （117.70±5.49）mmHg，P＜0.01] 明 顯 降 低； LVDP[（-0.30±1.03）mmHg vs （-6.81±0.43） mmHg，P＜0.01] 明顯升高；LVEDP [（12.93±2.43） mmHg vs （12.14±0.66）mmHg，P＞0.05] 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。左心室壓力下降速率[（2 427.90±219.20） mmHg/s vs（3 562.72±233.02） mmHg/s，P＜0.01] 和 下 降 速 率[（-2 543.73±164.40） mmHg/s vs （-3 464.82±206.30）mmHg/s，P＜0.01]明顯鈍化。左心室壓力-時(shí)間曲線可見(jiàn)：對(duì)照組左心室收縮期和舒張期壓力變化迅速、波形銳利，收縮平臺(tái)期較短且壓力可維持在較高水平；二尖瓣反流組動(dòng)物左心室收縮期和舒張期壓力變化緩慢、波形粗頓，收縮期峰壓力不能有效維持，反流造成壓力波形震顫。

表2 對(duì)照組與二尖瓣反流組術(shù)后6 個(gè)月血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（

表2 對(duì)照組與二尖瓣反流組術(shù)后6 個(gè)月血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（

注：+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓正向最大變化速率；-dp/dtmax：左心室內(nèi)壓負(fù)向最大變化速率。1 mmHg=0.133 kPa

平均動(dòng)脈壓 (mmHg) 88.40± 3.48 83.79±3.81 0.008動(dòng)脈收縮壓 (mmHg) 108.70±3.82 69.84±4.41 0.001動(dòng)脈舒張壓 (mmHg) 69.73±2.37 54.63±2.44 0.013左心室收縮末期壓力(mmHg) 117.70±5.49 86.66±5.60 ＜0.001左心室舒張末期壓力(mmHg) 12.14±0.66 12.93±2.43 0.762左心室舒張期最低壓(mmHg) -6.81±0.43 -0.30±1.03 0.002+dp/dtmax (mmHg/s) 3 562.72±233.02 2 427.90±219.20 0.005-dp/dtmax (mmHg/s) -3 464.82±206.30 -2 543.73±164.40 0.006

圖1 對(duì)照組與二尖瓣反流組術(shù)后6 個(gè)月血流動(dòng)力學(xué)左心室壓力-時(shí)間曲線

術(shù)后6 個(gè)月兩組動(dòng)物心臟形態(tài)、病理學(xué)變化：心臟取材后經(jīng)心尖-二尖瓣-左心房縱向剖開(kāi)大體觀察，二尖瓣反流組動(dòng)物二尖瓣后瓣腱索斷裂，瓣葉卷曲增厚，邊緣不規(guī)則增生，左心室心腔明顯擴(kuò)大，游離壁心肌增厚。左心室組織經(jīng)5 μm 厚度石蠟切片蘇木素-伊紅（HE）染色顯微鏡觀察：對(duì)照組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核大小形態(tài)均勻，肌束間存在少量間質(zhì)；二尖瓣反流組心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細(xì)胞肥大，部分輕度空泡樣變性或肌溶解，細(xì)胞核大小不等，心肌間質(zhì)明顯增多部分區(qū)有纖維條索，間質(zhì)中有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)馬松（Masson）染色顯示，二尖瓣反流組膠原等結(jié)締組織被染成藍(lán)色、心肌組織被染成粉紅色。經(jīng)顯微鏡觀察：二尖瓣反流組心肌間質(zhì)膠原明顯增多，結(jié)締組織相互連接成條索樣分布，部分區(qū)域有瘢痕形成（圖2）。

二尖瓣反流組與對(duì)照組術(shù)后6 個(gè)月H2S 和NTproBNP 變化（圖3）:二尖瓣反流組與對(duì)照組比較，血漿H2S水平明顯降低[ （27.48±2.78） μmol/L vs （37.87±3.55）μmol/L，P=0.044]，血清NT-proBNP 水平明顯升高[（2 132.00±212.30）μg/L vs （456.70±40.79）μg/L，P＜0.001]。

術(shù)后6 個(gè)月兩組動(dòng)物心臟重構(gòu)和H2S 合成體系相關(guān)蛋白和基因表達(dá)變化（圖4、圖5）：左心室心肌組織經(jīng)Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)，二尖瓣反流組與對(duì)照組比較，與心肌重構(gòu)相關(guān)的Collagen I（1.495±0.106 vs 1.023±0.067，P=0.003）、CollagenⅢ （1.413±0.042 vs 1.010±0.086，P=0.002 ）表 達(dá)明顯上調(diào)； H2S 合成相關(guān)的酶CSE（0.750±0.030 vs 1.012±0.018，P=0.001） 與CBS（0.676±0.123 vs 0.998±0.030，P=0.029 ）表達(dá)明顯下調(diào)。左心室組織制備的cDNA 文庫(kù)采用Real-time PCR 法檢測(cè)基因表達(dá)，二尖瓣反流組與對(duì)照組比較，心臟重構(gòu)相關(guān)Collagen Ⅰ（1.658±0.134 vs 0.995±0.076，P=0.002）、Collagen Ⅲ（1.805±0.120 vs 1.037±0.090，P=0.001 ） mRNA 表達(dá)含量明顯升高，H2S 合成體系CSE （0.690±0.064 vs 1.038±0.053，P＜0.001 ）、CBS（0.772±0.025 vs 1.003±0.019，P=0.002）mRNA 表達(dá)含量明顯降低。

圖2 術(shù)后6 個(gè)月兩組動(dòng)物左心室心肌病理學(xué)變化

圖3 兩組術(shù)后6 個(gè)月血漿H2S 與NT-proBNP 水平變化（n=6）

圖4 兩組術(shù)后6 個(gè)月心臟重構(gòu)與H2S 合成體系蛋白變化比較（n=6）

圖5 兩組術(shù)后6 個(gè)月心臟重構(gòu)與H2S 合成體系mRNA 表達(dá)水平比較（n=6）

3 討論

在本研究中，使用小型豬小切口非體外循環(huán)下二尖瓣腱索拉傷造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭模型，通過(guò)超聲心動(dòng)圖和在體血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)二尖瓣反流組動(dòng)物左心室擴(kuò)張、泵功能下降，病理學(xué)評(píng)價(jià)所見(jiàn)二尖瓣反流組動(dòng)物左心室發(fā)生明顯結(jié)構(gòu)重構(gòu)，通過(guò)分子生物學(xué)手段檢測(cè)二尖瓣反流動(dòng)物模型循環(huán)H2S 水平和心肌H2S 合成酶明顯降低。研究提示H2S 合成體系下調(diào)可能參與二尖瓣反流所致心肌重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)展過(guò)程。

對(duì)于慢性心力衰竭的研究，多集中在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎形成的缺血性心力衰竭或腎素-血管緊張素系統(tǒng)過(guò)度激活形成的心肌重構(gòu)等模型研究[10]。對(duì)于臨床中常見(jiàn)的壓力負(fù)荷增加性慢性心力衰竭的模型復(fù)制，大動(dòng)物水平能夠更真實(shí)地反映心血管血流動(dòng)力學(xué)變化，具有重要的價(jià)值。我們?cè)谇捌诖髣?dòng)物二尖瓣腱索拉傷模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良[7-8]，采用自制的“瓣膜損傷器”，經(jīng)心尖入路拉斷二尖瓣后葉腱索以形成穩(wěn)定的二尖瓣反流，持續(xù)6 個(gè)月后血清NT-proBNP 含量顯著增高，經(jīng)病理學(xué)和分子生物學(xué)評(píng)價(jià)左心室已發(fā)生明顯重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的損傷和間質(zhì)膠原的增生。本研究中二尖瓣反流組動(dòng)物經(jīng)心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVEF 和LVFS 未出現(xiàn)明顯減低，分析可能由于二維超聲相關(guān)參數(shù)計(jì)算的方法學(xué)在二尖瓣大量反流干擾下會(huì)出現(xiàn)偏差并不能客觀反映心室收縮功能[11]，經(jīng)在體功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)二尖瓣反流組動(dòng)物左心泵功能嚴(yán)重受損，提示在臨床診斷中對(duì)于二尖瓣反流患者不能僅憑借超聲心室收縮參數(shù)正常而輕視病情的發(fā)展。

Abe 等[12]發(fā)現(xiàn)，H2S 可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性產(chǎn)生，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)H2S 可參與機(jī)體的多種生理功能的調(diào)節(jié)如：介導(dǎo)血管平滑肌舒張、降低血壓、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、保護(hù)阿霉素對(duì)心肌的毒性作用、抑制炎性反應(yīng)等，被視為第三種氣體信號(hào)分子。H2S 可以在組織內(nèi)源性生成，調(diào)控合成的酶主要為CBS、CSE 兩種關(guān)鍵酶[4]，這兩種酶的分布具有組織特異性，在心血管系統(tǒng)主要由CSE 發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，近期發(fā)現(xiàn)在中樞系統(tǒng)存在3 -巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）也可生成H2S，但具體調(diào)控作用還有待研究[13]。H2S 通過(guò)抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生等作用維持心血管系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14]。在心肌缺血、血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的高血壓模型中H2S 水平下調(diào)，如外源性給予H2S 供體可抑制疾病的病理生理學(xué)進(jìn)展、保護(hù)靶器官的損傷[9，15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭模型心肌損傷與重構(gòu)，可能由于H2S 合成體系下降不能發(fā)揮相應(yīng)的保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，給予H2S合成的抑制劑炔丙基甘氨酸（PPG）可觀察到動(dòng)脈血壓升高[16]，在心肌缺血模型中阻斷H2S 合成可加重心肌損傷，外源性應(yīng)用硫氫化鈉作為供體補(bǔ)充H2S可減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。在由于二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭過(guò)程中，H2S 體系的下調(diào)使心肌的自我保護(hù)功能作用下降，形成病理性損傷，導(dǎo)致功能學(xué)和形態(tài)學(xué)發(fā)生重構(gòu)。由于H2S 的還原性可清除細(xì)胞應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧和自由基[7，17]，可作為保護(hù)心肌損傷的治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，二尖瓣反流慢性心力衰竭動(dòng)物模型H2S 合成體系下調(diào)，可能參與心肌重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)展。由于本實(shí)驗(yàn)采用大型動(dòng)物、模型制備困難，前期研究未設(shè)置H2S 補(bǔ)充治療實(shí)驗(yàn)組，目前基礎(chǔ)中最常采用的H2S 供體硫氫化鈉半衰期短，毒性較大且不能口服給藥，研制新型藥物載體有助于將H2S 作為治療手段應(yīng)用于臨床研究。