王艷麗，陳勝利，張鵬

心血管疾病已成為危害人類健康的第一大殺手[1-2]。據(jù)2017 年我國心血管病報告顯示，心血管疾病 的死亡率日趨上升，已成為我國居民死因的首位[3]。動脈粥樣硬化是心血管疾病 的主要病理學基礎(chǔ)，高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT）是機體清除過多膽固醇的唯一途徑。高密度脂蛋白（HDL）在RCT 中扮演重要角色，流行病學資料顯示，HDL 水平與心血管疾病呈負相關(guān)[4]。近年來，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP）抑制劑由于能明顯增加血漿HDL 水平受到極大關(guān)注[5-6]。然而，隨著CETP 抑制劑三期臨床試驗的失敗引起了我們對HDL 與心血管疾病關(guān)系的進一步思考[7]。目前的研究認為HDL 顆粒組成比HDL 水平更重要[8]。HDL 顆粒包含磷脂、膽固醇、載脂蛋白A1（apoA1）、apoA2、apoC、apoE 等成份，其中apoA1 約占70%，是HDL 顆粒的主要成份[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，存在一段長鏈非編碼RNA 為apoA1天然反義轉(zhuǎn)錄（apoA1-NAT)，可抑制apoA1 mRNA表達[10]。本研究通過不同濃度阿托伐他汀干預人急性單核細胞白血病細胞1（THP1）誘導的巨噬細胞，觀察是否能抑制apoA1-NAT，升高apoA1 mRNA 表達，同時觀察是否能調(diào)節(jié)與脂代謝有關(guān)的三磷酸腺苷綁定的盒式轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）、清道夫受體B1(SRB1) 及低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

阿托伐他汀鈣（Sigma 公司、美國），胎牛血清（Life Technologies 公司、美國）、RPMI-1640（康寧公司，美國）、佛波酯（上海翊圣生物科技有限公司）、RNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物TAKARA）。

1.2 方法

1.2.1 人THP1 培養(yǎng)及誘導： THP1 株由西安醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所中心實驗室趙玉峰教授惠贈。細胞從液氮中取出后迅速于37℃水浴鍋中溶解，將凍存管中的液體轉(zhuǎn)入含有10 ml 培養(yǎng)液的15 ml 離心管中離心（5 min 800 r/min )。棄上清，加入1 ml 培養(yǎng)液，將離心后的細胞團吹打為單懸液，然后將離心管中的細胞轉(zhuǎn)移至加有3 ml 培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中，于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞匯合度達到90%時即可傳代。傳3～5 代的細胞進行誘導。取對數(shù)生長期的THP1，以5×105個/孔的濃度種于6孔細胞培養(yǎng)板，加入佛波酯100 ng/ml 誘導24 h，使其分化成為巨噬細胞。細胞匯合度達到80%時加阿托伐他汀進行藥物干預。

1.2.2 藥物干預：二甲基亞砜溶解阿托伐他汀，用培養(yǎng)液配制成不同濃度：0、1、10、100 nmol/L（nM）。將6 孔板中細胞上層液體吸干凈，向6 孔板中加入不同濃度的阿托伐他汀，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時間點（6、12、24、48 h）提取細胞總RNA。

1.2.3 設(shè)計引物：登錄NCBI 網(wǎng)站，根據(jù)表1 中基因登錄號檢索下列待測基因的RNA 序列。根據(jù)檢索到的基因序列，用primer5 設(shè)計引物，并送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.4 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測：取上述各組阿托伐他汀干預的巨噬細胞，用天根試劑盒（DP430）提取總RNA。得到的總RNA在核酸蛋白檢測儀上測其濃度，并測定A260/A280吸光度，A260/A280 在2.0～2.2 之間，然后取1 000 ng總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制實時定量PCR 反應體系20 μl，檢測巨噬細胞apoA1-NAT 及脂代謝相關(guān)基因表達。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，54 ℃退火延伸40 s，此兩步重復進行39 次；72℃延伸10 min。反應結(jié)束后分析擴增曲線、溶解曲線，采用 2-△△Ct法計算目的基因的表達量。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.3 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（Mean±SE）表示，多樣本均數(shù)的比較采用one-way ANOVA 分析，Dunnett 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

THP1 經(jīng)佛波酯誘導成為巨噬細胞: 對數(shù)生長期的THP1 細胞，以5×105個/ 孔的濃度種于6 孔板，用100 ng/ml 佛波酯誘導24 h，使其分化成為巨噬細胞，由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長狀態(tài)（圖1）。

不同濃度阿托伐他汀干預24 h 巨噬細胞狀態(tài):用0、1、10、100 nM 的阿托伐他汀干預巨噬細胞，并于6 h、12 h、24 h、48 h 觀察檢測，可見10 nM阿托伐他汀干預24 h 后，巨噬細胞狀態(tài)良好（圖2），做為我們重點分析的濃度和時間點。

圖1 人急性單核細胞白血病細胞1 經(jīng)100 ng/ml 佛波酯誘導24h 成為巨噬細胞

圖2 不同濃度阿托伐他汀干預巨噬細胞24 h

阿托伐他汀對 apoA1-NAT 表達的影響：阿托伐他汀干預24 h，隨著藥物濃度的增加apoA1-NAT 表達量明顯下降，并呈濃度依賴性下降（P 均＜0.05，圖3A）。用10 nM 阿托伐他汀進行干預時，apoA1-NAT 表達量呈時間依賴性下降（P 均＜0.001,圖3B）。

阿托伐他汀對 apoA1 表達的影響：10 nM 阿托伐他汀作用24 h 時apoA1 表達量明顯增加（P＜0.001），1 nM 和100 nM 時無明顯改變（P 均＞0.05，圖4A）。10 nM 阿托伐他汀進行干預時，apoA1 表達量在12 h、24 h 均顯著升高（P 均＜0.001），而48 h 表達量變化不明顯（P＞0.05，圖4B）。

圖3 阿托伐他汀對載脂蛋白A1 天然反義轉(zhuǎn)錄表達的影響（n=3）

阿托伐他汀干預對SRB1 表達的影響：不同濃度阿托伐他汀干預巨噬細胞24 h，SRB1 表達量均呈濃度依賴性升高，100 nM 時升高最顯著（P 均＜0.01，圖5A）。用10 nM 阿托伐他汀干預不同時間，SRB1 表達量呈時間依賴性升高（P 均＜0.01，圖5B）。阿托伐他汀可明顯增加SRB1 表達，并且呈時間和濃度依賴性升高。

阿托伐他汀對 ABCA1 表達的影響：1 nM 和100 nM 阿托伐他汀干預巨噬細胞24 h 時ABCA1 表達量均有明顯增加，而10 nM 時ABCA1 表達量增加更顯著（P 均＜0.001，圖6A）。10 nM 阿托伐他汀進行干預12 h、24 h 時，ABCA1 表達量均顯著升高（P均＜0.01），而隨著時間的延長至48 h 時表達量逐漸回落（P＞0.05，圖6B）。

圖5 阿托伐他汀對清道夫受體B1 表達的影響（n=3）

圖6 阿托伐他汀對三磷酸腺苷綁定的盒式轉(zhuǎn)運體A1 表達的影響（n=3）

阿托伐他汀對 LDLR 表達的影響: 1nM 和10 nM的阿托伐他汀干預巨噬細胞24 h 時LDLR 表達量均明顯增加（P 均＜0.01），100 nM 時LDLR 表達量無明顯改變（P＞0.05，圖7A）。10 nM 阿托伐他汀干預12 h、24 h 時LDLR 表達量均顯著升高（P 均＜0.001），而48h 表達量無明顯改變（P＞0.05，圖7B）。

圖7 阿托伐他汀對低密度脂蛋白受體表達的影響（n=3）

3 討論

目前在我國，心血管疾病死亡率日趨上升，已成為重大的公共衛(wèi)生問題[3]。阿托伐他汀，又名立普妥，是目前臨床應用最廣泛的降血脂保護心血管藥物，在降低血漿LDL 水平的同時，可輕度升高HDL[11]。HDL 在RCT 過程中發(fā)揮重要作用，apoA1是HDL 的主要成分，apoA1 在促進膽固醇外流及抗動脈粥樣硬化中的作用已在多項實驗中得到了驗證[12-14]。近年來長鏈非編碼 RNA 在心血管疾病中的作用越來越受到關(guān)注[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA apoA1-NAT 可抑制apoA1 表達。本研究利用阿托伐他汀干預THP1 誘導的巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制巨噬細胞apoA1-NAT 表達，并且呈時間和濃度依賴性降低。當10 nM 阿托伐他汀使細胞內(nèi)apoA1-NAT 被抑制最明顯時，apoA1 表達量增加最顯著。因此，本實驗結(jié)果提示利用他汀可抑制巨噬細胞apoA1-NAT 同時增加apoA1 表達。

ApoA1 在RCT 過程中扮演著重要角色。經(jīng)典的RCT 過程是外周組織游離膽固醇經(jīng)ABCA1 受體流出，與apoA1 結(jié)合，apoA1 可激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT），并在LCAT 催化下形成preβ-HDL，再經(jīng)LCAT 進一步酯化使表面的游離膽固醇酯化為膽固醇酯，形成成熟的HDL。HDL 可通過肝細胞表面SRB1 受體結(jié)合，其中的膽固醇酯被選擇性攝取代謝。在本研究中我們觀察到阿托伐他汀可明顯增加SRB1 表達，呈時間和濃度依賴性升高。并且不同濃度阿托伐他汀干預12 h 或24 h，均可顯著升高ABCA1 表達量。這些結(jié)果提示阿托伐他汀可促進RCT 過程中游離膽固醇經(jīng)過ABCA1 受體的流出，以及促進HDL 通過SRB1 攝取代謝。

LDL 與HDL 在CETP 介導下進行脂質(zhì)交換。生成的LDL 可通過細胞表面的LDLR 攝取代謝。本研究發(fā)現(xiàn)1 nM 和10 nM 阿托伐他汀干預12 h 或24 h，均可顯著升高細胞表面LDLR 表達量。該結(jié)果提示，阿托伐他汀可促進LDL 通過細胞表面LDLR 的清除，與既往的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，阿托伐他汀可抑制巨噬細胞內(nèi)apoA1-NAT 表達，進而使apoA1 表達增加，同時促進了RCT 過程中ABCA1、SRB1 及LDLR 表達，有利于外周組織游離膽固醇的流出，以及膽固醇酯的清除。本研究將深入探索，為新的抗動脈粥樣硬化治療靶點提供實驗依據(jù)。