王艷麗，陳勝利，張鵬

心血管疾病已成為危害人類健康的第一大殺手[1-2]。據(jù)2017 年我國心血管病報告顯示，心血管疾病 的死亡率日趨上升，已成為我國居民死因的首位[3]。動脈粥樣硬化是心血管疾病 的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）是機(jī)體清除過多膽固醇的唯一途徑。高密度脂蛋白（HDL）在RCT 中扮演重要角色，流行病學(xué)資料顯示，HDL 水平與心血管疾病呈負(fù)相關(guān)[4]。近年來，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP）抑制劑由于能明顯增加血漿HDL 水平受到極大關(guān)注[5-6]。然而，隨著CETP 抑制劑三期臨床試驗(yàn)的失敗引起了我們對HDL 與心血管疾病關(guān)系的進(jìn)一步思考[7]。目前的研究認(rèn)為HDL 顆粒組成比HDL 水平更重要[8]。HDL 顆粒包含磷脂、膽固醇、載脂蛋白A1（apoA1）、apoA2、apoC、apoE 等成份，其中apoA1 約占70%，是HDL 顆粒的主要成份[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，存在一段長鏈非編碼RNA 為apoA1天然反義轉(zhuǎn)錄（apoA1-NAT)，可抑制apoA1 mRNA表達(dá)[10]。本研究通過不同濃度阿托伐他汀干預(yù)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞1（THP1）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，觀察是否能抑制apoA1-NAT，升高apoA1 mRNA 表達(dá)，同時觀察是否能調(diào)節(jié)與脂代謝有關(guān)的三磷酸腺苷綁定的盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）、清道夫受體B1(SRB1) 及低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

阿托伐他汀鈣（Sigma 公司、美國），胎牛血清（Life Technologies 公司、美國）、RPMI-1640（康寧公司，美國）、佛波酯（上海翊圣生物科技有限公司）、RNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物TAKARA）。

1.2 方法

1.2.1 人THP1 培養(yǎng)及誘導(dǎo)： THP1 株由西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室趙玉峰教授惠贈。細(xì)胞從液氮中取出后迅速于37℃水浴鍋中溶解，將凍存管中的液體轉(zhuǎn)入含有10 ml 培養(yǎng)液的15 ml 離心管中離心（5 min 800 r/min )。棄上清，加入1 ml 培養(yǎng)液，將離心后的細(xì)胞團(tuán)吹打?yàn)閱螒乙海缓髮㈦x心管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加有3 ml 培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中，于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時即可傳代。傳3～5 代的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。取對數(shù)生長期的THP1，以5×105個/孔的濃度種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入佛波酯100 ng/ml 誘導(dǎo)24 h，使其分化成為巨噬細(xì)胞。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時加阿托伐他汀進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.2.2 藥物干預(yù)：二甲基亞砜溶解阿托伐他汀，用培養(yǎng)液配制成不同濃度：0、1、10、100 nmol/L（nM）。將6 孔板中細(xì)胞上層液體吸干凈，向6 孔板中加入不同濃度的阿托伐他汀，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時間點(diǎn)（6、12、24、48 h）提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 設(shè)計引物：登錄NCBI 網(wǎng)站，根據(jù)表1 中基因登錄號檢索下列待測基因的RNA 序列。根據(jù)檢索到的基因序列，用primer5 設(shè)計引物，并送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.4 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測：取上述各組阿托伐他汀干預(yù)的巨噬細(xì)胞，用天根試劑盒（DP430）提取總RNA。得到的總RNA在核酸蛋白檢測儀上測其濃度，并測定A260/A280吸光度，A260/A280 在2.0～2.2 之間，然后取1 000 ng總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制實(shí)時定量PCR 反應(yīng)體系20 μl，檢測巨噬細(xì)胞apoA1-NAT 及脂代謝相關(guān)基因表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，54 ℃退火延伸40 s，此兩步重復(fù)進(jìn)行39 次；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線，采用 2-△△Ct法計算目的基因的表達(dá)量。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，多樣本均數(shù)的比較采用one-way ANOVA 分析，Dunnett 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

THP1 經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞: 對數(shù)生長期的THP1 細(xì)胞，以5×105個/ 孔的濃度種于6 孔板，用100 ng/ml 佛波酯誘導(dǎo)24 h，使其分化成為巨噬細(xì)胞，由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長狀態(tài)（圖1）。

不同濃度阿托伐他汀干預(yù)24 h 巨噬細(xì)胞狀態(tài):用0、1、10、100 nM 的阿托伐他汀干預(yù)巨噬細(xì)胞，并于6 h、12 h、24 h、48 h 觀察檢測，可見10 nM阿托伐他汀干預(yù)24 h 后，巨噬細(xì)胞狀態(tài)良好（圖2），做為我們重點(diǎn)分析的濃度和時間點(diǎn)。

圖1 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞1 經(jīng)100 ng/ml 佛波酯誘導(dǎo)24h 成為巨噬細(xì)胞

圖2 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h

阿托伐他汀對 apoA1-NAT 表達(dá)的影響：阿托伐他汀干預(yù)24 h，隨著藥物濃度的增加apoA1-NAT 表達(dá)量明顯下降，并呈濃度依賴性下降（P 均＜0.05，圖3A）。用10 nM 阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)時，apoA1-NAT 表達(dá)量呈時間依賴性下降（P 均＜0.001,圖3B）。

阿托伐他汀對 apoA1 表達(dá)的影響：10 nM 阿托伐他汀作用24 h 時apoA1 表達(dá)量明顯增加（P＜0.001），1 nM 和100 nM 時無明顯改變（P 均＞0.05，圖4A）。10 nM 阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)時，apoA1 表達(dá)量在12 h、24 h 均顯著升高（P 均＜0.001），而48 h 表達(dá)量變化不明顯（P＞0.05，圖4B）。

圖3 阿托伐他汀對載脂蛋白A1 天然反義轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響（n=3）

阿托伐他汀干預(yù)對SRB1 表達(dá)的影響：不同濃度阿托伐他汀干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h，SRB1 表達(dá)量均呈濃度依賴性升高，100 nM 時升高最顯著（P 均＜0.01，圖5A）。用10 nM 阿托伐他汀干預(yù)不同時間，SRB1 表達(dá)量呈時間依賴性升高（P 均＜0.01，圖5B）。阿托伐他汀可明顯增加SRB1 表達(dá)，并且呈時間和濃度依賴性升高。

阿托伐他汀對 ABCA1 表達(dá)的影響：1 nM 和100 nM 阿托伐他汀干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h 時ABCA1 表達(dá)量均有明顯增加，而10 nM 時ABCA1 表達(dá)量增加更顯著（P 均＜0.001，圖6A）。10 nM 阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)12 h、24 h 時，ABCA1 表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.01），而隨著時間的延長至48 h 時表達(dá)量逐漸回落（P＞0.05，圖6B）。

圖5 阿托伐他汀對清道夫受體B1 表達(dá)的影響（n=3）

圖6 阿托伐他汀對三磷酸腺苷綁定的盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 表達(dá)的影響（n=3）

阿托伐他汀對 LDLR 表達(dá)的影響: 1nM 和10 nM的阿托伐他汀干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h 時LDLR 表達(dá)量均明顯增加（P 均＜0.01），100 nM 時LDLR 表達(dá)量無明顯改變（P＞0.05，圖7A）。10 nM 阿托伐他汀干預(yù)12 h、24 h 時LDLR 表達(dá)量均顯著升高（P 均＜0.001），而48h 表達(dá)量無明顯改變（P＞0.05，圖7B）。

圖7 阿托伐他汀對低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

目前在我國，心血管疾病死亡率日趨上升，已成為重大的公共衛(wèi)生問題[3]。阿托伐他汀，又名立普妥，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的降血脂保護(hù)心血管藥物，在降低血漿LDL 水平的同時，可輕度升高HDL[11]。HDL 在RCT 過程中發(fā)揮重要作用，apoA1是HDL 的主要成分，apoA1 在促進(jìn)膽固醇外流及抗動脈粥樣硬化中的作用已在多項實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[12-14]。近年來長鏈非編碼 RNA 在心血管疾病中的作用越來越受到關(guān)注[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA apoA1-NAT 可抑制apoA1 表達(dá)。本研究利用阿托伐他汀干預(yù)THP1 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制巨噬細(xì)胞apoA1-NAT 表達(dá)，并且呈時間和濃度依賴性降低。當(dāng)10 nM 阿托伐他汀使細(xì)胞內(nèi)apoA1-NAT 被抑制最明顯時，apoA1 表達(dá)量增加最顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示利用他汀可抑制巨噬細(xì)胞apoA1-NAT 同時增加apoA1 表達(dá)。

ApoA1 在RCT 過程中扮演著重要角色。經(jīng)典的RCT 過程是外周組織游離膽固醇經(jīng)ABCA1 受體流出，與apoA1 結(jié)合，apoA1 可激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT），并在LCAT 催化下形成preβ-HDL，再經(jīng)LCAT 進(jìn)一步酯化使表面的游離膽固醇酯化為膽固醇酯，形成成熟的HDL。HDL 可通過肝細(xì)胞表面SRB1 受體結(jié)合，其中的膽固醇酯被選擇性攝取代謝。在本研究中我們觀察到阿托伐他汀可明顯增加SRB1 表達(dá)，呈時間和濃度依賴性升高。并且不同濃度阿托伐他汀干預(yù)12 h 或24 h，均可顯著升高ABCA1 表達(dá)量。這些結(jié)果提示阿托伐他汀可促進(jìn)RCT 過程中游離膽固醇經(jīng)過ABCA1 受體的流出，以及促進(jìn)HDL 通過SRB1 攝取代謝。

LDL 與HDL 在CETP 介導(dǎo)下進(jìn)行脂質(zhì)交換。生成的LDL 可通過細(xì)胞表面的LDLR 攝取代謝。本研究發(fā)現(xiàn)1 nM 和10 nM 阿托伐他汀干預(yù)12 h 或24 h，均可顯著升高細(xì)胞表面LDLR 表達(dá)量。該結(jié)果提示，阿托伐他汀可促進(jìn)LDL 通過細(xì)胞表面LDLR 的清除，與既往的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，阿托伐他汀可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)apoA1-NAT 表達(dá)，進(jìn)而使apoA1 表達(dá)增加，同時促進(jìn)了RCT 過程中ABCA1、SRB1 及LDLR 表達(dá)，有利于外周組織游離膽固醇的流出，以及膽固醇酯的清除。本研究將深入探索，為新的抗動脈粥樣硬化治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。