張 萍

(咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

馬鈴薯為經(jīng)濟(jì)型作物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且產(chǎn)量高，屬糧蔬兼用型食物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活食用中備受青睞。隨著馬鈴薯深加工的不斷創(chuàng)新和快餐行業(yè)的發(fā)展，馬鈴薯食品的發(fā)展方向也由鮮食型轉(zhuǎn)向加工型和專用型?？蒲泄ぷ髡叱Ｓ没蚬こ碳夹g(shù)定向改造基因以改變其性狀特征，獲得新品質(zhì)特征的馬鈴薯，研究培育出一些優(yōu)質(zhì)的抗病蟲害的馬鈴薯新品種。以馬鈴薯作為基因工程研究作物，主要是利用馬鈴薯可以通過無性繁殖快速將轉(zhuǎn)基因性狀傳遞給后代的優(yōu)勢(shì)[1]。

實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯NHD3、NC、NF的莖段為外植體，用根癌農(nóng)桿菌研究馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化效率，篩選出適合誘導(dǎo)馬鈴薯新品種NHD3、NC、NF愈傷組織生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，進(jìn)而研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化遺傳體系，并分別比較菌液濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，以便為相關(guān)研究提供參考及我們后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)馬鈴薯栽培品種NHD3、NC、NF無菌試管苗。

(2)癌農(nóng)桿菌LBA4404(植物表達(dá)載體：pARTG F1-2)。

1.2 試劑及其配制

抗生素、激素以及MS培養(yǎng)基的配制[2]，具體操作如下：

1.3 MS母液配制

(1)母液Ⅰ(20×)：每升含33 g NH4NO3、38 g KNO3、8.8 g CaCl2·2H2O、7.4 g MgS·7H2O、3.4 g KH2PO4；

(2)母液Ⅱ(200×)：每升含166 mgKI、1 240 mg H3BO3、4 460 mg MnSO4·4H2O、1 720 mg ZnSO4·7H2O、50 mg Na2MoO4·2 d H2O、50 mg CaSO4·5H2O、5 mg CoCl2·6H2O；

(3)母液Ⅲ(100×)：每升含5 560 mg FeSO4·7H2O、7 400 mg Na2·EDTA·2H2O；

(4)母液Ⅳ(200×)：每升含100 mg煙酸、100 mg鹽酸吡哆醇、400 mg甘氨酸、20 mg VB1；

1.4 激素配制

(1)NAA(1 mg·mL-1)：稱取100 mg固體NAA，溶解于適量0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中，用蒸餾水定容至100 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

(2)IAA(1 mg·mL-1)：稱取100 mg固體IAA，溶解于適量0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中，用蒸餾水定容至100 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

(3)6-BA(0.5 mg·mL-1)：稱取100 mg固體6-BA，溶解于少量稀鹽酸中，用蒸餾水定容至200 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

1.5 培養(yǎng)基

1.5.1 YEB培養(yǎng)基 每升含5.0 g牛肉浸膏、1. 0 g酵母浸膏、5. 0 g蛋白胨、0.5 g MgSO4·7H2O、0. 8 %瓊脂(pH 值7. 2)。

1.5.2 植物培養(yǎng)基 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)整NAA 濃度，配制成A、B、C、D、E、F六種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于篩選愈傷組織誘培養(yǎng)基，具體組成如下：

A：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA

B：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA

C：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.3 mg·L-1NAA

D：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.4 mg·L-1NAA

E：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA

F：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.6 mg·L-1NAA

1.6 儀器

雙面超凈工作臺(tái)(SW-CJ-ZF，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；小型高壓滅菌鍋(TH-1020，臺(tái)灣TIAOHTSTN公司)；光照培養(yǎng)箱(GZP-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SHP-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；氣浴式震蕩器(ZJS-1320，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(KL-RO-20，成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)；電熱恒溫水浴鍋(HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 篩選培養(yǎng)基

2.1.1 組織培養(yǎng)苗的復(fù)壯 無菌條件將分別剪取三種馬鈴薯NHD3、NC、NF組培苗莖段若干，含一個(gè)腋芽，約1.0～2.0 cm，接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接種6～8個(gè)莖段，每個(gè)品種接種5～7瓶，培養(yǎng)條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養(yǎng)時(shí)間15 d左右。

2.1.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 無菌條件下剪取長(zhǎng)勢(shì)良好的組織培養(yǎng)苗莖段若干，無腋芽，約1.0～2.0 cm，分別接種于1.6.2中所制的六種不同培養(yǎng)基中，每瓶接種6～8個(gè)莖段，每個(gè)品種接種5～7瓶，培養(yǎng)條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養(yǎng)時(shí)間：20 d。統(tǒng)計(jì)愈傷發(fā)生率。

2.2 研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化遺傳體系

2.2.1 復(fù)壯 無菌條件剪取NHD3馬鈴薯組培苗莖段若干，含一個(gè)腋芽，約1.0～2.0 cm，接種于MS培養(yǎng)基中，接種6～8個(gè)莖段，培養(yǎng)條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養(yǎng)時(shí)間：15 d左右。

2.2.2 預(yù)培養(yǎng) 無菌條件剪取生長(zhǎng)健壯的復(fù)壯組培苗莖段若干，無腋芽，約0.8～1.5 cm，接種于預(yù)培養(yǎng)基中，接種6～8個(gè)莖段，預(yù)培養(yǎng)條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養(yǎng)時(shí)間：10 d左右。

2.2.3 根瘤工程農(nóng)桿菌菌液制備 將工程農(nóng)桿菌LBA4404(含有pARTGF1-2)放入含Kan(70 mg·L-1)、Rif(80 mg·L-1)、Str(40 mg·L-1)的YEB培養(yǎng)基溶液中，避光振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：28℃，260 rpm。培養(yǎng)時(shí)間：24～36h。活化菌液后，按1 ∶50的比例進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為4、6、8、10、12、14、16 h，取不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液各取2 mL，測(cè)定OD600值，確定出農(nóng)桿菌達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的最適振蕩培養(yǎng)時(shí)間。將達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，5 000 rpm離心5 min后收集菌體，加入MS培養(yǎng)基并稀釋至所需濃度。

2.2.4 轉(zhuǎn)化方法 首先對(duì)外植體組培苗進(jìn)行兩天的預(yù)培養(yǎng)，再進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，最后對(duì)侵染后的外植體置于黑暗環(huán)境進(jìn)行共培養(yǎng)。方法：剪取健壯外植體組培莖段(約0.5 cm，無腋芽)，接種于培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱(條件：16 h·d-1、25±1℃、光照強(qiáng)度2 000 Lx)預(yù)培養(yǎng)2 d，預(yù)培養(yǎng)后對(duì)農(nóng)桿菌懸液進(jìn)行侵染，并不斷搖晃使菌液與外植體充分接觸，數(shù)分鐘后取出，拭去表面菌液，再轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于黑暗環(huán)境28℃進(jìn)行共培養(yǎng)。

2.2.5 優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系[4,5]為研究不同轉(zhuǎn)化條件對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

(1)農(nóng)桿菌濃度的影響。不同離心條件培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌菌液，調(diào)整OD600值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，加入MS液體培養(yǎng)基中，分別轉(zhuǎn)化培養(yǎng)馬鈴薯無菌苗。

(2)莖段預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的影響。剪取生長(zhǎng)健壯的NHD3組培苗莖段(0.8～1.0 cm，無腋芽)，接種于預(yù)培養(yǎng)基中，在25+ 1℃、1 500Lx光照下預(yù)培養(yǎng)。

(3)共培養(yǎng)時(shí)間的影響。預(yù)培養(yǎng)的外植體在OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液中浸染8～10 min后，接種于MS固體培養(yǎng)基上，黑暗條件下共培養(yǎng)時(shí)間分別為1 d 、2 d 、3 d、4 d、5 d、6 d。

3 結(jié)果與分析

3.1 馬鈴薯莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

馬鈴薯莖段在A、B、C、D、E、F六種馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，莖段邊緣開始長(zhǎng)出愈傷，20 d后，外植體分化出愈傷組織基本完成時(shí)，統(tǒng)計(jì)各品種馬鈴薯出愈外植體個(gè)數(shù)(結(jié)果見表1)。從中可以看出NC、NF、NHD3依次在B、D、C型培養(yǎng)基上出愈率最高，誘導(dǎo)率分別為94.44、97.50、97.56，在這三種培養(yǎng)基中愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，新芽呈新綠色、結(jié)構(gòu)致密。

3.2 菌液濃度的影響

取10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌菌液，5 000 rpm離心5 min，棄上清液，取菌體制備不同濃度梯度的菌液MS培養(yǎng)基，研究農(nóng)桿菌的不同濃度影響愈傷組織形成效率。結(jié)果表明，菌液濃度在OD600為0.6的濃度時(shí)誘愈率最高，形成愈傷組織數(shù)最多。濃度在OD600為0.2～1.0時(shí)可形成愈傷組織。

表1 馬鈴薯莖段愈傷誘導(dǎo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

注：+++：生長(zhǎng)呈新綠色，結(jié)構(gòu)致密；++：生長(zhǎng)呈淺綠色，結(jié)構(gòu)較為致密 +：生長(zhǎng)呈淺綠色，結(jié)構(gòu)疏松。

表2 菌液濃度影響愈傷組織形成統(tǒng)計(jì)

3.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的影響

農(nóng)桿菌侵染前對(duì)外植體進(jìn)行短時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，可緩解侵染時(shí)農(nóng)桿菌傷害外植體，促進(jìn)細(xì)胞分裂，使其更容易整合外源DNA，提高轉(zhuǎn)化效率[6]。由表3可知，莖段抗性愈傷率達(dá)最高，預(yù)培養(yǎng)的最佳時(shí)間為2 d。

表3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間影響愈傷組織形成統(tǒng)計(jì)

3.4 共培養(yǎng)時(shí)間的影響

外植體被農(nóng)桿菌浸染后受體細(xì)胞不能立即整合外源基因，需經(jīng)過一定時(shí)間的來完成轉(zhuǎn)移整合[7]。共培養(yǎng)時(shí)間過短或過長(zhǎng)，均會(huì)影響到轉(zhuǎn)化效率。所以，確定共培養(yǎng)時(shí)間是形成愈傷轉(zhuǎn)化的重要因素。由表4可知，共培養(yǎng)2 d，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

表4 共培養(yǎng)時(shí)間影響愈傷組織形成統(tǒng)計(jì)

4 小結(jié)與討論

(1)實(shí)驗(yàn)通過組織培養(yǎng)的方法研究馬鈴薯莖段的再生能力，以便建立高效的馬鈴薯再生體系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。研究表明誘導(dǎo)不同品種馬鈴薯莖段形成愈傷組織需要不同種類的激素及濃度[8～9]，使用較多的激素種類為6-BA 、NAA、IAA等，其中6-BA的濃度范圍為1.0～2.0 mg·L-1，本實(shí)驗(yàn)中確定6-BA 的使用濃度為1.0 mg·L-1。而細(xì)胞生長(zhǎng)素在NAA中活力高，且耐高溫、高壓不易被光分解破壞，所以本實(shí)驗(yàn)選用NAA。從試驗(yàn)結(jié)果來看，“NC”、“NF”、“NHD3”品種在6-BA濃度一致、培養(yǎng)時(shí)間為20 d左右時(shí)，分別以NAA 為0. 2 mg·L-1、0.3mg·L-1、0.4 mg·L-1時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好。本試驗(yàn)結(jié)果與李娟等報(bào)道[13]的相一致。

(2)研究影響轉(zhuǎn)化效率因素得出結(jié)論：① 轉(zhuǎn)化馬鈴薯莖段需要適當(dāng)時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)可促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂[10]，使受體細(xì)胞易于整合外源DNA，提高轉(zhuǎn)化效率[11-13]。②確定共培養(yǎng)時(shí)間是遺傳轉(zhuǎn)化效率重要的影響因素，是實(shí)現(xiàn)外源基因向外植體轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵[14]。③合適的農(nóng)桿菌濃度會(huì)影響到外植體形成轉(zhuǎn)化植株[15]。本實(shí)驗(yàn)在濃度為OD600= 0.6的農(nóng)桿菌菌液中浸染10 min，抗性愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)87.25%。