宋珂，侯彥宏，蘇都娜，楊會(huì)，白云綺，李慧，婁利霞，趙一舟，吳愛明，圖雅，聶波*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥發(fā)展研究中心，北京 100700；3.內(nèi)蒙古赤峰市安定醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029

《中國心血管病報(bào)告2017》發(fā)布心腦血管疾病目前仍然是人類死亡的首要原因，而動(dòng)脈粥樣硬化(arterosclerosis，AS)是作為其發(fā)生發(fā)展的最重要的病理基礎(chǔ)。AS被認(rèn)為是一種慢性炎癥性的脂類在血管內(nèi)皮下沉積的代謝疾病[1]，病因病機(jī)尚未完全明確，而炎癥反應(yīng)貫穿于AS起始、進(jìn)展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是斑塊不穩(wěn)定發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)[2]。其中炎性細(xì)胞因子在AS的發(fā)生發(fā)展中的互相作用也成為AS研究中的一個(gè)新領(lǐng)域。

鑒于AS炎癥反應(yīng)與中醫(yī)毒邪致病特點(diǎn)的相似之處，本課題在既往的中醫(yī)痰瘀病機(jī)基礎(chǔ)上，提出從毒論治理念，采用具有解毒活血作用的四妙勇安湯干預(yù)AS病變。目前，四妙勇安湯在AS相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用日益廣泛。王立茹[3]認(rèn)為在明確有頸動(dòng)脈粥樣硬化的患者長期加服適量加味四妙勇安湯可能有助于減輕頸動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，穩(wěn)定斑塊從而減輕腦梗死的發(fā)病率。還有以四妙勇安湯為主方加減，治療血栓閉塞性脈管炎、動(dòng)脈硬化性閉塞癥、下肢深靜脈血栓、雷諾氏病、糖尿病周圍血管神經(jīng)病變等周圍血管性疾病均能取得滿意的療效[4-5]。

既往研究工作從動(dòng)物及細(xì)胞水平均證實(shí)四妙勇安湯干預(yù)AS有效，對相關(guān)炎性因子具有調(diào)節(jié)作用[6-7]。本研究采用經(jīng)典的“西方膳食”[8]誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型，觀察四妙勇安湯對小鼠主動(dòng)脈的病理改變，以及白介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)炎癥因子的影響，進(jìn)一步研究四妙勇安湯防治AS斑塊療效及可能的抗炎作用機(jī)制，為臨床中對AS疾病的中醫(yī)治療開拓多途徑、多靶點(diǎn)的用藥思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物和飼料

C57BL/6小鼠，雄性，7周齡，體質(zhì)量18～20 g，SPF級；ApoE-/-小鼠，雄性，7周齡，體質(zhì)量18～20 g，SPF級；小鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。室溫保持22～24 ℃，相對濕度50%，12 h交替照明，飲水不限，自由攝食。本研究獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行[編號：京中東內(nèi)(2016)06號]。高脂飼料配方為21%脂肪+0.15%膽固醇+78.85%基礎(chǔ)飼料，均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號為：SCXK(京)2014-0010，飼料均經(jīng)60Co γ照射滅菌處理。

1.2 藥物及試劑

阿托伐他汀鈣片(立普妥，輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20051408，產(chǎn)品批號：N37492)；四妙勇安組方：金銀花(批號：15051904)90 g、當(dāng)歸(批號：150313061)60 g、玄參(批號：150181431)90 g、甘草(批號：150280731)30 g，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥房，由本實(shí)驗(yàn)室水煎濃縮制備，分裝4 ℃保存；RnD多因子檢測試劑盒，貨號：LXSAMSM-09，批號：L122950。

1.3 儀器

OLYMPUS BX60光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，HANGPING JA 1003N精準(zhǔn)天平(上海儀器儀表廠)，XTT型000037體視鏡(上海勤奮儀器廠)，AU5800全自動(dòng)生化測定儀(美國BECKMAN COULTER 公司)，Centrifuge 5424R低溫多用途離心機(jī)(德國eppendorf公司)，X-200Luminex液態(tài)芯片(澳大利亞Luminex)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立、分組與給藥

所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，C57BL/6J為正常對照組，給予基礎(chǔ)飼料，Apo E-/-小鼠給予高脂飼料喂飼14周后，隨機(jī)抽取10只，檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，取主動(dòng)脈行HE染色，觀察AS模型形成情況。確定成模后將剩余ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組，陽性藥阿托伐他汀組，四妙勇安湯高、中、低劑量組，每組10只。四妙勇安湯高、中、低劑量組及陽性藥組均依照“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值”計(jì)算各組臨床等效劑量換算，分別按照34.9、23.14、11.68、2.57 g·kg-1灌胃給藥。除對照組之外，其余各組均繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，對照組和模型組給予等劑量的去離子水，每日1次，連續(xù)給藥12周。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)

給藥12周后進(jìn)行取材，取材前夜禁食不禁水，摘除眼球取血，將其麻醉過量致死，2500 r·min-1，4 ℃離心20 min，分離血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C含量。

2.3 病理組織學(xué)分析

取血后，取其小鼠主動(dòng)脈根部，置于4%多聚甲醛中固定，手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)連續(xù)切片，厚度3 μm，進(jìn)行HE染色。在100倍光鏡下對組織切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行觀察并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。測量指標(biāo)為內(nèi)膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、血管管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)，其中IT、PA、IT/MT及PA/LA取其均值入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見圖1。

注：IT=[(內(nèi)彈力板周長/π-殘腔周長/π)/2]；MT=[(外彈力板周長/π-內(nèi)彈力板周長/π)/2]；LA=內(nèi)彈力板圍繞面積；PA=內(nèi)彈力板圍繞面積-殘腔面積；內(nèi)中膜比值=IT/MT；主動(dòng)脈狹窄率=PA/LA×100%。圖1 主動(dòng)脈PA、IT、PA/LA、IT/MT具體測量方法

2.4 血清細(xì)胞因子檢測

取血后，4 ℃離心，分離血清后，采用Luminex液態(tài)芯片檢測技術(shù)，嚴(yán)格按照X-200Luminex操作方法操作，檢測血清中IL-6和MCP-1炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠對血脂的影響

高脂喂養(yǎng)14周后，經(jīng)血脂檢測及HE染色后確定模型建立，繼續(xù)給藥12周后，進(jìn)行血脂檢測，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C明顯提高(P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組及四妙勇安湯高、中、低劑量組TC、TG、LDL-C及HDL-C無明顯的變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

3.2 各組小鼠對主動(dòng)脈根部病理形態(tài)的影響

HE染色顯示：對照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，無AS斑塊形成。與正常對照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈根部內(nèi)膜明顯增厚(P<0.01)，中膜平滑肌排列紊亂且萎縮變薄，內(nèi)中膜厚度比值明顯增大(P<0.01)；主動(dòng)脈斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶沉積，斑塊面積明顯增大(P<0.01)，斑塊與管腔面積比明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組主動(dòng)脈根部內(nèi)膜比較完整，厚度較模型組明顯減少(P<0.01)，中膜平滑肌排列規(guī)則，內(nèi)中膜厚度比值明顯減小(P<0.01)；主動(dòng)脈內(nèi)膜局部僅有少量泡沫細(xì)胞的形成，斑塊面積明顯減小(P<0.01)，僅四妙勇安湯高劑量組的斑塊與管腔面積比明顯降低(P<0.01)，其余各給藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各給藥組的病變程度明顯輕于模型組，但四妙勇安湯高、中、低各組與陽性藥組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、4。

3.3 各組小鼠對MCP-1及IL-6的影響

與對照組比較，模型組IL-6明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，同時(shí)四妙勇安湯各劑量組IL-6的表達(dá)均明顯下降(P<0.01)，尤以四妙勇安湯中劑量組更為明顯(見圖5)。

與對照組比較，模型組MCP-1明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組MCP-1明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)四妙勇安湯高劑量組及低劑量組明顯下降(P<0.01)，四妙勇安湯中劑量組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5)。

注：A.TC；B.TG；C.HDL-C；D.LDL-C；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖2 各組ApoE-/-小鼠對血脂的影響

注：A.對照組；B.模型組；C.陽性藥組；D.四妙高劑量組；E.四妙中劑量組；F.四妙低劑量組。圖3 各組小鼠主動(dòng)脈的病理形態(tài)影響(蘇木素伊紅染色，100×)

注：A.內(nèi)膜厚度；B.斑塊面積；C.管腔狹窄率；D.內(nèi)中膜厚度比。圖4 各組小鼠對主動(dòng)脈PA、IT、PA/LA、IT/MT比較

注：A.IL-6；B.MCP-1。圖5 各組小鼠血清IL-6和MCP-1的比較

4 討論

本研究采用西方飲食高脂飼料配方飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠，因未予外界物理損傷干預(yù)，充分模擬了正常人的AS過程，是評價(jià)AS的經(jīng)典的造模方法，而且這種高脂血癥小鼠的脂紋病變及廣泛的纖維斑塊損傷，與人類AS病變的發(fā)生、發(fā)展過程及病變部位均十分相似，目前已成為探討高血脂癥及其所致AS發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及研究干預(yù)手段的極佳動(dòng)物模型。越來越多的研究表明，他汀類藥物通過它們的多效性，如通過改善內(nèi)皮功能障礙、穩(wěn)定斑塊、抗炎作用等發(fā)揮抑制AS作用[9-10]，但有研究報(bào)道顯示他汀類藥物不具有降低ApoE-/-小鼠的膽固醇作用，與其缺乏合成膽固醇的LDLr和LDLr相關(guān)蛋白的臨界配體(ApoE)有關(guān)[11]。在類似的實(shí)驗(yàn)條件下，Sparrow等均證實(shí)以上觀點(diǎn)[12-13]。本研究結(jié)果與其一致，他汀類藥物不具有降低ApoE-/-小鼠血脂作用。

在AS發(fā)生和發(fā)展過程中，動(dòng)脈內(nèi)膜是炎癥反應(yīng)最早累及的部位，尤其是大中型動(dòng)脈內(nèi)膜。內(nèi)膜增厚是AS的早期征象，反映動(dòng)脈血管對脂質(zhì)浸潤和炎癥的反應(yīng)。主動(dòng)脈是AS最常見、最易累及的大血管之一，PA、IT、PA/LA、IT/MT是診斷AS的早期指征，是心腦血管疾病重要的危險(xiǎn)因素與預(yù)測因子。本研究中主動(dòng)脈HE染色觀察到模型組有典型粥樣斑塊形成、內(nèi)膜明顯增厚、斑塊內(nèi)大量脂質(zhì)沉積及炎性細(xì)胞浸潤，而四妙勇安湯干預(yù)后很好地改善這一現(xiàn)象，局部僅有少量泡沫細(xì)胞的形成，AS斑塊面積明顯減小，病變程度明顯輕于模型組。與模型組比較，四妙勇安湯高中低劑量組的PA、IT及IT/MT明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步研究明確四妙勇安湯能夠降低斑塊面積、減少內(nèi)膜厚度、有效減輕AS的病變程度。

Tzoulaki等[14]報(bào)道，IL-6是AS進(jìn)程中的炎癥標(biāo)志物，同時(shí)也是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。IL-6能夠?qū)⒓毙匝仔苑磻?yīng)放大，促進(jìn)慢性炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)的一個(gè)中樞性調(diào)節(jié)因子[15]。MCP-1是被確認(rèn)的具有趨化及活化單核/巨噬細(xì)胞的重要趨化細(xì)胞因子之一[16]。在AS病變后期，MCP-1能夠使斑塊趨向不穩(wěn)定，導(dǎo)致斑塊破裂[17]。最新的研究報(bào)道顯示，AS斑塊中MCP-1的豐度可能表明它在AS的起始、形成和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[18]，是加速AS形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[19]。相關(guān)研究表明，IL-6可以使巨噬細(xì)胞分泌MCP-1，使單核細(xì)胞聚集進(jìn)入血管內(nèi)皮下，參與形成粥樣硬化斑塊[20]；MCP-1能活化白細(xì)胞并介導(dǎo)其產(chǎn)生炎性介質(zhì)，如IL-6等，持續(xù)過度的IL-6產(chǎn)生破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM1和VCAM1，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子如MCP-1，進(jìn)而趨化IL-6本身[21]，使得心血管疾病發(fā)生率更進(jìn)一步提高。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，四妙勇安湯高、中、低劑量組血清中IL-6和MCP-1水平明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01、P<0.05)，說明四妙勇安湯能夠有效降低ApoE-/-小鼠AS模型的IL-6和MCP-1的表達(dá)，從而抑制炎癥穩(wěn)定AS斑塊的作用。

本方以玄參、金銀花滋陰清熱解毒為君，當(dāng)歸養(yǎng)血活血、化瘀散結(jié)為佐，甘草調(diào)和諸藥為使，系清養(yǎng)結(jié)合、瘀毒并驅(qū)、標(biāo)本兼治、共助滋陰解毒活血之法，是解毒活血的代表方?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，四妙勇安湯中含有綠原酸、甘草苷、木犀草素等化學(xué)成分，具有顯著的抗菌消炎、抗氧化、清除自由基、降脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[22-23]，這些藥物成分是四妙勇安湯發(fā)揮抑制炎癥、穩(wěn)定斑塊的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，四妙勇安湯發(fā)揮抗AS作用與炎癥機(jī)制關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)研究以ApoE-/-小鼠為研究對象，采用經(jīng)典西方膳食構(gòu)建AS模型，并使用解毒活血法的代表方四妙勇安湯進(jìn)行早期干預(yù)，結(jié)果表明，四妙勇安湯可以通過抑制炎性因子IL-6和MCP-1表達(dá)，進(jìn)而抑制AS的炎癥反應(yīng)、降低內(nèi)膜厚度、減少斑塊面積等，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊的藥理作用，然而其具體的抗炎分子機(jī)制有待于更深層次的研究。