龔藝貞，鄧騰，廖錫文，王向坤，馬輝△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科 廣西南寧 530021

3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科 廣西南寧 530021

2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示新發(fā)結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）病例超過180萬例，死亡人數(shù)超過86萬例，約占全部癌癥病例和死亡人數(shù)的10%，CRC在癌癥發(fā)病率中排名第三，在死亡率中排名第二［1］。與許多其他癌癥一樣，CRC被視為一種異質(zhì)性疾病，遺傳變異、細(xì)胞環(huán)境和外部環(huán)境影響與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)［2］。超過60%的CRC發(fā)生在結(jié)腸［3］，結(jié)腸癌與直腸癌的病因并不一樣［1,3-5］，所以二者的發(fā)病機(jī)制也可能不同，結(jié)腸癌中最常見的病理類型是結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinom，COAD）。既往的多項(xiàng)研究已經(jīng)描述了幾種潛在的機(jī)制，包括多種分子改變，它們參與結(jié)腸直腸癌發(fā)生和進(jìn)展過程［6-8］。但目前未有研究對(duì)全基因組參與的結(jié)腸腺癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析，本研究通過分析癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://cancergenome.nih.gov/）中COAD的全基因組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集中癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織的GSEA分析即富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA），探索結(jié)腸腺癌的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 倫理認(rèn)可

本研究使用TCGA數(shù)據(jù)符合TCGA的出版指南（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/res earch/structural-genomics/tcga/using-tcga/citing-tcga）相關(guān)內(nèi)容，所有TCGA中的COAD數(shù)據(jù)現(xiàn)在可以在出版物或演示文稿中不受限制地使用。本研究中各組基因RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集均來自TCGA，而非作者通過對(duì)人類參與者或動(dòng)物所做的任何試驗(yàn)研究獲得，不需經(jīng)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)集下載和預(yù)處理

COAD的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集從TCGA下載（https://cancergenome.nih.gov；訪問日期：2018年11月30日）。檢索式為Project id is TCGA-COAD AND Workflow Type is HTSeq-Counts AND Experimental Strategy is RNA-Seq。下載的全基因組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集由DESeq包在R平臺(tái)中進(jìn)行歸一化，將其中基因表達(dá)量平均值小于1的基因剔除。

1.3 GSEA分析

以COAD患者癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織作為分組變量，使用GSEA2-2.2.3版本分析癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織全基因組基因表達(dá)變化對(duì)各種生物學(xué)功能和通路的影響。本研究分別使用來自分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（molecular signatures database，MSigDB）的“c2:curated gene sets（c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt）”和“c5:gene ontology(GO)gene sets（c5.all.v6.2.symbols.gmt）”作為參照基因集進(jìn)行GSEA富集分析。Number of permutations設(shè)置為重復(fù)1000次［9-10］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GSEA中的FDR根據(jù)Benjamini-Hochberg程序進(jìn)行校正［11］。|NES|＞1、Norminal-P＜0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25的富集結(jié)果被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究從TCGA的COAD隊(duì)列中獲得456例患者的480個(gè)癌組織標(biāo)本和41個(gè)癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本的Level 3全基因組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，一共獲得15 768個(gè)編碼基因。

在以c5為參照基因集的GSEA分析中，作者發(fā)現(xiàn)在COAD患者癌組織中可以顯著富集到細(xì)胞周期G1 S期轉(zhuǎn)變（cell cycle G1 S phase transition）、DNA復(fù)制（DNA replication）和DNA修復(fù)（DNA repair）等生物學(xué)功能，而在癌旁正常結(jié)腸組織中富集到與脂質(zhì)分解代謝過程（lipid catabolic process）、脂肪酸分解代謝過程（fatty acid catabolic process）和調(diào)節(jié)鈣跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（regulation of calcium transmembrane transporter activity）等生物學(xué)功能（圖1）；在以c2為參照基因集的GSEA分析在癌組織中富集到細(xì)胞周期（cell cycle）通路、DNA復(fù)制（DNA replication）通路和核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair）等代謝通路，在癌旁正常結(jié)腸組織中富集到PPAR信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、自噬的調(diào)節(jié)（regulation of autophage）通路和趨化因子信號(hào)通路（chemokine signaling pathway）等代謝通路（圖2）。

圖1 COAD癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織以c5參考基因集的GSEA富集分析

圖2 COAD癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織以c2參考基因集的GSEA富集分析

3 討論

TCGA計(jì)劃是2006年由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（the national cancer institute，NCI）和國(guó)家人類基因組研究所（the national human genome research institute，NHGRI）發(fā)起，包含人類33種癌癥數(shù)據(jù)，含有超過兩萬個(gè)原發(fā)癌和與其匹配的正常樣本。TCGA采用大規(guī)模測(cè)序和基因組分析，通過廣泛的合作，匯集來自不同學(xué)科和多個(gè)機(jī)構(gòu)的研究人員研究癌癥的分子機(jī)制，提高對(duì)癌癥分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，提升對(duì)癌癥的診斷、治療和預(yù)防能力。

本研究通過GSEA分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中COAD的癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織的全基因組mRNA表達(dá)差異進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，GO富集分析結(jié)果顯示COAD的腫瘤發(fā)生可能與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能有關(guān)。Soreide等［12］報(bào)道細(xì)胞周期和凋亡與CRC的預(yù)后相關(guān)。Potter等［13］的研究提示高脂肪飲食，特別是動(dòng)物脂肪，與CRC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。大量攝入動(dòng)物脂肪會(huì)增加患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)［14］。Bernstein等［15］的進(jìn)一步研究證實(shí)脂肪可能通過產(chǎn)生氧化物和脂肪酸而致癌。Djamgoz等［16］的研究顯示癌細(xì)胞的遷移通過調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀或其粘附來響應(yīng)各種機(jī)械和化學(xué)信號(hào)，而癌細(xì)胞中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)與正常細(xì)胞中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)存在很大的差異。

在參與COAD發(fā)生發(fā)展的通路分析結(jié)果中，PPAR信號(hào)通路通常與Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑一起作用參與結(jié)腸癌的形成和調(diào)節(jié)過程［17-19］。Zhou等［20］的研究提示自噬與癌癥的致瘤和保護(hù)作用有關(guān)。然而，自噬在CRC中的作用仍不清楚。本研究富集到的自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路可能有助于未來進(jìn)一步研究自噬對(duì)COAD發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。既往的研究顯示趨化因子CXC亞家族基因與CRC的發(fā)生發(fā)展有廣泛的相關(guān)［21］，Ma等［22］的研究提示沉默趨化因子CXCL12基因通過下調(diào)MAPK/PI3K/AP-1信號(hào)通路，可顯著抑制某些類型結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，侵襲和血管生成能力。

本研究通過利用TCGA全基因組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，通過GSEA手段對(duì)結(jié)腸腺癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)、復(fù)制與脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過程，以及細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、核酸修復(fù)、PPAR、趨化因子和自噬等相關(guān)通路可能參與結(jié)腸腺癌的發(fā)生，但這些機(jī)制仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。