李常有， 于志強(qiáng)， 崔軍威， 楊滿， 朱麗璋， 韋偉

(北京大學(xué) 深圳醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科, 廣東 深圳 518036)

1 材料

1.1 材料與儀器

MDA-MB-231細(xì)胞(三陰性乳腺癌細(xì)胞)，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).293-T細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher 公司.全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司.corning costar Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室，美國(guó)康寧公司.蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司10 cm培養(yǎng)皿，Nest公司24孔板，美國(guó)康寧公司倒置熒光顯微鏡，萊卡公司.

1.2 藥品與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品.澳洲胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品.Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，sigma公司產(chǎn)品.Puromycin，invivogen公司產(chǎn)品.pLVX-U6-shRNA-EF1a-coGFP及包裝質(zhì)粒，深圳上為生物科技有限公司.Crystal violet，sigma公司.Lipofectamine 2000，Penicilin-Streptomycin,PierceTMBCA Protein Assay Kit，美國(guó)thermo Fisher公司.UltraSignal 超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物，北京四正柏生物科技有限公司.Anti-c-Myc antibody[Y69]ab32072,abcam公司.Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) ab205718，abcam公司.c-mycshRNA載體，序列(GGAAACGACGAGA-ACAGTTGA), 深圳市上為生物科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM高糖培養(yǎng)基+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%澳洲胎牛血清+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%雙抗，無(wú)菌條件下操作，3 d傳代培養(yǎng)1次.

1.3.2 慢病毒包裝

將pLVX-U6-c-mycshRNA-EF1a-coGFP載體、PCMV-VSVG、PCMV-Pax2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；pLVX-U6-NC-EF1a-coGFP載體、PCMV-VSVG、PCMV-Pax2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，48 h后分別收獲并濃縮病毒液，分裝并長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80 ℃.

1.3.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及篩選

將處于對(duì)數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞收集，均勻鋪于24孔板，10萬(wàn)/孔.將收集的病毒液分別感染目的細(xì)胞，48 h后觀察熒光，并用含有Puromycin 4 μg/mL的高糖培養(yǎng)基篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株.

假設(shè)2臺(tái)機(jī)組正在運(yùn)行，系統(tǒng)負(fù)荷變小時(shí)，冷凍供水泵將減小所供應(yīng)的水量，機(jī)組感應(yīng)到水量變小，即反映到機(jī)組的負(fù)荷相應(yīng)減小，當(dāng)2臺(tái)機(jī)組的負(fù)荷達(dá)到或者小于1臺(tái)機(jī)組的總負(fù)荷時(shí)，控制系統(tǒng)啟動(dòng)減機(jī)延時(shí)，延時(shí)一段時(shí)間后關(guān)掉其中一臺(tái)機(jī)組，使另一臺(tái)機(jī)組在高負(fù)荷狀況下能夠同時(shí)滿足系統(tǒng)負(fù)荷的要求。

1.3.4 Western印跡分析

用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞，用Pierce裂解液和蛋白酶抑制劑(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 ∶1)混勻shRNA組和對(duì)照(NC)組細(xì)胞，提取蛋白.用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)，用BCA標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[4]，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～10%SDS—PAGE分離等份的蛋白質(zhì)(20 mg).將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，將其在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的TBST(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%Tween-20的TBS)中室溫封閉1 h，然后在4 ℃用Anti-c-Myc antibody孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次15 min，羊抗兔IgG H&L孵育2 h，UltraSignal 超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影.

1.3.5 c-myc敲低抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞2 000/孔的細(xì)胞懸液,96孔板培養(yǎng)(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2).分別于24、48、72 h后，加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液.全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值[5].

1.3.6 c-Myc敲低抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合的實(shí)驗(yàn)

在6孔板內(nèi)均勻鋪細(xì)胞3×106/孔，12 h用20 μL槍頭劃直線，PBS洗2次，更換低血清(質(zhì)量濃度<2%)培養(yǎng)基.將細(xì)胞放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并于0、24 h拍照.

1.3.7 c-myc敲低抑制Transwell Assay

將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞以低血清培養(yǎng)基配成6×105/mL.取100 μL均勻鋪于transwell上室，下室加入600 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%FBS的高糖培養(yǎng)基，選取24 h拍照.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

c-Myc敲低對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率曲線圖由GraphPad Prism 軟件繪制.c-Myc敲低三陰性乳腺癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)采用photoshop測(cè)量，GraphPad Prism繪圖.c-Myc敲低抑制Transwell Assay由imagej2x統(tǒng)計(jì)，GraphPad Prism繪圖.統(tǒng)計(jì)方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 c-Myc的基因敲低

應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)GFP熒光表達(dá)水平，表明帶有pLVX-U6-c-mycshRNA-EF1a-coGFP載體，pLVX-U6-NC-EF1a-coGFP載體的病毒感染成功(圖1).緊接著對(duì)shRNA和NC組進(jìn)行westernblot蛋白定量及灰度值統(tǒng)計(jì)分析.shRNA組蛋白表達(dá)量降低為NC組的1/3,重復(fù)3次，灰度值P<0.01為極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2).

A:NC組GFP綠色熒光表達(dá)(×200); B:shRNA組GFP綠色熒光表達(dá)(×200)

A:westernblot驗(yàn)證c-myc蛋白表達(dá)量; B:重復(fù)3次westernblot得到的灰度值測(cè)量統(tǒng)計(jì)圖.

2.2 c-Myc蛋白對(duì)三陰性乳腺癌增殖影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與NC對(duì)照組比較，shRNA能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖2倍.NC組和shRNA組MDA-MB-231細(xì)胞相同處理后，于24、48、72 h測(cè)量OD值，GraphPad Prism繪增殖曲線，shRNA組增值速率降低一半.24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)P<0.01(圖3),具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

圖3 c-Myc蛋白影響三陰性乳腺癌增值曲線

Fig.3 c-Myc protein affects the growth of triple negative breast cancer

2.3 c-Myc敲低抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合

c-Myc蛋白敲低后，降低劃痕愈合的速度，抑制三陰性乳腺癌的遷移.0、24 h，10倍鏡下觀察NC組和c-Myc敲低組劃痕愈合情況，肉眼可見(jiàn)shRNA組愈合速度減慢(圖4A),具極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，圖4B).

2.4 c-myc敲低抑制Transwell Assay

從Transwell Assay結(jié)果證明shRNA組遷移率明顯低于NC組.可觀測(cè)出24 h，shRNA組遷移速率明顯低于NC組(圖5A).重復(fù)3次由imagej2x，GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)分析，具極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1，圖5B),可得shRNA組遷移速率明顯低于NC組.

A：0、24 h劃痕鏡下圖(×200); B：劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析圖

A: 24 h NC組和shRNA組遷移圖(×200); B：重復(fù)3次統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

c-myc基因已經(jīng)被研究多年.在1983年Minna等[6]首次提出c-myc基因在肺癌中的高表達(dá).隨后人們發(fā)現(xiàn)c-myc基因在多種腫瘤中被激活[7].c-myc基因在30%～50%的高分化乳腺癌中高表達(dá)[8].在三陰性乳腺癌中，c-myc基因也顯著高表達(dá)[9].

c-Myc蛋白的高表達(dá)也給乳腺癌患者帶來(lái)了高風(fēng)險(xiǎn)，并且已有將c-Myc蛋白作為三陰性乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物的研究報(bào)道[10].其結(jié)果得到了Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)的支持，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3 951名乳腺癌患者進(jìn)行了生存相關(guān)性分析(圖6)，結(jié)果顯示c-Myc蛋白與患者生存風(fēng)險(xiǎn)存在正相關(guān)性，c-Myc蛋白表達(dá)越低，死亡風(fēng)險(xiǎn)越低.c-Myc蛋白表達(dá)量在200個(gè)月后與生存相關(guān)性更加明顯.c-myc基因的編碼蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子活性，有促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，降低細(xì)胞黏附性的作用[11].c-Myc蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)MYC結(jié)合因子MAX具有特異性結(jié)合區(qū)域[12].這種結(jié)合復(fù)合物通過(guò)G1期調(diào)控細(xì)胞周期從而影響細(xì)胞增殖.本實(shí)驗(yàn)證明c-Myc蛋白的敲低，明顯降低乳腺癌細(xì)胞的增殖(圖3).c-Myc蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控部分受到細(xì)胞周期依賴性激酶調(diào)控[13].在三陰性乳腺癌中c-Myc蛋白的高表達(dá)伴隨著P53、RB等腫瘤抑制因子的丟失，可能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移[9-14].c-Myc蛋白的顯著敲低可能導(dǎo)致MYC結(jié)合因子結(jié)合部位減少，進(jìn)一步降低對(duì)G1期的調(diào)控而影響細(xì)胞的增殖.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明c-Myc蛋白能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，但尚未驗(yàn)證P53、RB、MYC結(jié)合因子的相關(guān)性，這有待進(jìn)一步的探索.近年來(lái)，腫瘤的遷移侵襲機(jī)制逐漸被揭示，有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞骨架重組是不可或缺的因素[15].由myc基因誘導(dǎo)的、與骨架蛋白F-actin息息相關(guān)的細(xì)胞間的嵌入和黏附力部分揭示了組織的遷移侵襲與被破壞[16].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明應(yīng)用shRNA敲低c-Myc之后腫瘤細(xì)胞遷移能力明顯降低.這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致.但是，c-Myc蛋白是如何影響三陰性乳腺癌的遷移功能，本實(shí)驗(yàn)尚未做出進(jìn)一步研究.c-Myc蛋白作為增殖信號(hào)通路的重要成員，其下游分子CyclinD1、CyclinE、CDK4/6,P53、RB、F-actin等相關(guān)分子將作為新的方向來(lái)研究c-Myc蛋白對(duì)三陰性乳腺癌的功能影響.c-Myc蛋白對(duì)三陰性乳腺癌的明顯促進(jìn)作用、對(duì)早期三陰性乳腺癌化療耐藥的誘導(dǎo)作用都有利于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)c-Myc抑制劑[17]，給三陰性乳腺癌患者帶來(lái)福音.

綜上，三陰性乳腺癌因其表面受體均為陰性的特征，為臨床治療帶來(lái)一定的受限.但是，c-Myc蛋白的高表達(dá)及對(duì)三陰性乳腺癌的增殖、遷移等功能的明顯促進(jìn)作用，在今后的治療方面可能可以通過(guò)抑制c-Myc蛋白來(lái)調(diào)控三陰性乳腺癌的發(fā)展和愈后.