張青松 朱傳衛(wèi) 王三六 趙吉光 沈俊 周琳

安徽宣城市中心醫(yī)院1檢驗科，2腫瘤科，3普外科（安徽宣城242000）；4江蘇省太湖康復醫(yī)院檢驗科（江蘇無錫214086）

胃癌（gastric cancer，GC）是我國高發(fā)的腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計顯示我國胃癌的發(fā)病率在腫瘤中位于第二位（男性第二，女性第四）［1］，嚴重地影響了群眾的健康。胃癌是一個復雜的疾病，其發(fā)病是一個慢性的病理過程?，F(xiàn)有研究顯示，胃癌的發(fā)病與是環(huán)境因素和遺傳因素相關。其中幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染被證實為明確的胃癌致癌因子，被定為Ⅰ類致癌因素。

整合素是細胞表面的異二聚體蛋白家族，其介導細胞與基質(zhì)及細胞與細胞之間的相互作用。該家族蛋白的18 個α-亞單位及8 個β-亞單位形成25 種整合素［2］。整合素介導的信號對細胞的粘附、擴散、遷移、增殖、分化、等都起到關鍵作用。此外，其還與多種腫瘤的發(fā)生及轉移相關［3-4］。研究顯示整合素α1β1 的表達上調(diào)與胃腸道粘膜的炎癥相關并與胃癌的發(fā)生相關［5］。研究［6-7］顯示整合素的遺傳多態(tài)性與胃癌的發(fā)病風險相關，亦有研究顯示［8］其與胃癌的治療及預后相關。因此進一步探討整合素家族基因的遺傳多樣性與胃癌的發(fā)病及病理的相關性對于胃癌的發(fā)病機制及預后判斷有著重要的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究招募2013年7月至2018年6月于安徽宣城市中心醫(yī)院經(jīng)病理診斷為胃癌的患者設為病例組。同期招募在醫(yī)院健康體檢結果且無消化道疾病史者為健康對照組。上述二組人群均抽取以肝素抗凝的靜脈血，400 ×g 離心10 min，然后分別收集血細胞與血漿，凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)抗體檢測及基因分型。病例組組成為男186 例，女67 例，平均年齡（64.63 ± 12.17）歲。健康對照組組成為男213 例，女94 例，平均年齡（63.6±12.30）歲。

1.2 試劑和儀器 DNA 提取試劑盒購自西安金磁納米生物技術有限公司；PCR 擴增儀為美國ABI 公 司GeneAmp PCR System 9700 型。蛋白 核 酸檢測儀購自美國Thermo 公司；MassARRAY 平臺所用的點樣儀及質(zhì)譜儀為美國Sequenom 公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；Iplex Gold Reagent kit 為美國Sequenom 公司產(chǎn)品。幽門螺桿菌檢測試劑盒由上海凱創(chuàng)生物技術公司產(chǎn)品。

1.3 樣本DNA提取 所有受試者取抗凝全血3 mL分離得到的白細胞，基因組DNA 提取采用GoldMag全血基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑說明書步驟進行，主要步驟如下：（1）破碎紅細胞：向加入紅細胞裂解液，充分裂解后以500 ×g離心10 min，棄上清，留下沉淀；（2）破碎白細胞：向步驟1 管中加入白細胞裂解液及蛋白酶K，用以破碎白細胞；（3）清洗磁粒：取1 mL 充分搖勻的磁性微粒加入到一新離心管中，置于磁性分離器上，待溶液澄清后棄去上清，并向離心管中按一定的比例加入結合液BC，將離心管置于渦旋振蕩器上渦旋混勻15 s 后備用；（4）結合：將步驟3 中處理好的磁性微粒轉移到裝有步驟2 中已裂解的樣本離心管中，將離心管置于渦旋振蕩器上渦旋混勻15 s 后室溫放置5 min，然后將離心管置于磁性分離器上磁性分離5 min，待溶液澄清后棄去上清；（5）清洗Ⅰ：向離心管中加入清洗液并混勻15 s后置于磁性分離器上磁性分離，待溶液澄清后棄上清；（6）清洗Ⅱ：向離心管中加入清洗液Ⅱ，混勻15 s 后置于磁性分離器分離棄上清；（7）洗脫：加入洗脫液，混勻15 s 后置于磁性分離器上，收集上清中的DNA 到1.5 mL 離心管中，將離心管置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。基因組提取后采用NaniDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀并分析其純度與濃度。

1.4 多態(tài)性位點的選擇與分析基因多態(tài)性位點選擇 以中國人群最小等位基因頻率為0.05?；蚨鄳B(tài)性位點位于整合素家族基因上，見表1。所選擇的基因分型采用美國Sequenom 公司MassARRAY 平臺進行分析。該平臺分析基因型主要為以下幾個步驟：（1）PCR 擴增反應：采用多重PCR 擴增含有多態(tài)性位點的序列片斷；（2）SAP 純化：SAP是一個純化的過程，主要采用蝦堿酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）來消化PCR 擴增體系中多與的dNTPs 和引物；（3）Iplex 單堿基延伸反應：利用多重PCR 擴增后的產(chǎn)物，針對該位點再設計一條延伸引物，延伸引物在iplex 酶的作用下進行單堿基延伸反應。根據(jù)SNP 位點的不同，探針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測出這種分子量差異，從而實現(xiàn)SNP 分型的目的；（4）樹脂純化：向每個反應體系中加入Clean Resin（樹脂），混勻15 min 后離心5 min，其目的是為了去除前三步反應中殘余的雜質(zhì)；（5）點樣：使用MassArray 點樣儀將制備好的樣本點到檢測芯片的相應位置上；（6）質(zhì)譜分析：利用MALDI產(chǎn)生離子常用飛行時間（Time-of-Flight，TOF）檢測器來檢測不同的核酸片斷，不同的等位基因會產(chǎn)生不同的質(zhì)譜牲，從而得到相應的檢測結果；（7）結果分析：使用SequenomTyper 4.0 Software 觀看和分析實驗結果，得出不同的基因型。

表1 多態(tài)性位點信息Tab.1 Information of polymorphisms

1.5 Hp 感染檢測 采用膠體金法，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作并判讀結果。主要步驟如下：用加樣吸管往加樣孔內(nèi)垂直滴加1 滴（大約20 μL）。然后立即垂直加入3～4 滴樣品稀釋液，加樣后5 min 判斷結果；判讀陽性為質(zhì)控線（C 線）和檢測線（T 線）各有一條紅色線條出現(xiàn)，表明樣本中存在胃幽門螺旋桿菌尿素酶抗體。判讀陰性為只有質(zhì)控線（C 線）有一條紅色線條，而檢測線（T 線）無紅色線條出現(xiàn)，則指示胃幽門螺旋桿菌尿素酶抗體或胃幽門螺旋桿菌尿素酶抗體低于檢出水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS 11.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)、百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。對照組的各多態(tài)性位點的基因型采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg 平衡檢測。采用二分類因變量Logistic 回歸分析多態(tài)性位點的與胃癌風險的關系，以風險比（OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示相對風險度，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 病例組及健康對照組的性別、年齡、吸煙等方面差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但病例組的飲酒者比例顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組中H.pylori 感染陽性為151 例（49.19%），病例組為132 例陽性（52.17%），二組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。經(jīng)對對照組進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡（HWE）檢驗，結果顯示各位點均符合該定律（P＞0.05），認為具有群體代表性，見表2。病例組依臨床分期T1-T2 為79 例（31.23%），T3-T4 為174 例（68.77%）。依據(jù)臨床部位為賁門癌80 例（31.62%），非賁門癌173 例（68.38%）。

表2 胃癌組及健康對照組的臨床資料Tab.2 Clinical characteristics of participants 例（%）

2.2 各基因型在病例組及對照組中的分布及其與胃癌易感性關系 ITGA1rs2447867 位點在病例與對照組的分布有統(tǒng)計學差異，Logistic 回歸分析顯示rs244786TC（校正后OR= 1.69，95%CI：1.16～2.45，χ2=7.574，P=0.006）、TT（校正后OR=2.23，95%CI：1.25～4.00，χ2=7.303，P=0.007）及TC/TT（校正后OR=1.75，95%CI：1.23～2.50，χ2=9.411，P= 0.002）基因型與胃癌的發(fā)病風險相關。其他各位點的基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.3 ITGA1rs2447867 位點的亞組分析 ITGA1 rs2447867 位點經(jīng)亞組進行l(wèi)ogistic 回歸分析顯示，年齡＞60 歲組各基因型均胃癌的發(fā)病風險相關（TCvs.CC：校正后OR=2.05，95%CI：1.27～2.31，χ2= 8.507，P= 0.003；TTvs.CC：校正后OR= 2.58，95%CI：1.18～5.63，χ2= 5.667，P= 0.017；TC/TTvs.CC：校正后OR= 2.07，95%CI：1.31～3.28，χ2=9.702，P= 0.002），而在年齡≤60 歲組，僅有TT 基因型與胃癌的發(fā)病風險相關（TTvs.CC：校正后OR=2.90，95%CI：1.09～7.67，χ2=1.580，P=0.032）。此外在腫瘤部位分組中亦顯示，在非賁門癌中，各基因型均與胃癌的發(fā)病風險相關（TCvs.CC：校正后OR= 1.78，95%CI：1.17～2.72，χ2=7.191，P=0.007；TTvs.CC：校正后OR=2.68，95%CI：1.41～5.08，χ2= 9.080，P= 0.003；TC/TTvs.CC：校正后OR=1.90，95%CI：1.27～2.84，χ2=9.746，P=0.002），而在賁門癌中見未相關性。該位點在其他分組中分布差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

3 討論

本研究采用病例-對照分析了整合素基因家族5 個基因的多態(tài)性位點與胃癌發(fā)病風險的相關性。結果顯示，ITGA1rs2447867 多態(tài)性位點是胃癌發(fā)病的風險因素。進一步亞組分析顯示，該位點與年齡＞60 歲的人群胃癌發(fā)病風險相關，且與非賁門癌發(fā)病風險相關。

ITGA1 位于染色體5q11.2，其編碼整合素的α1 亞單位。研究顯示其與胃癌細胞粘附及轉移相關［9］。此外，在韓國人群的一項研究中也發(fā)現(xiàn)ITGA1rs2447867 與胃癌的發(fā)病風險相關［7］，與本研究結果相一致。對其功能研究推測該位點是一個外顯子拼接增強子，導致蛋白翻譯后剪切的異常，因此與胃癌的發(fā)病風險相關［7］。整合素是細胞粘附分子主要倡導細胞之間、細胞與胞外基質(zhì)及細胞與病原體的相互作用，其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，如介導白細胞遷移、突觸形成、吞噬作用等［10］，因此在病原體感染導致胃部疾病進展乃至胃癌的發(fā)生過程中，整合素作為介導細胞間的作用及免疫系統(tǒng)的改變發(fā)揮著重要作用［11］。ITGA1編碼整合素受體的α1 亞單位，其與β1 亞單位形成一個異源二聚體進而與膠原及層粘連蛋白結合，參與細胞之間的粘附并在介導免疫與纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。該基因還被證實與膠原相互作用，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白的活性與腫瘤的發(fā)生相關［12］。亦有研究報道，整合素α1β1 在胃腸道炎癥過程中表達上調(diào)，進而與胃癌的發(fā)生有潛在的關聯(lián)［5］。此外，細胞及臨床研究進一步證實整合素α1 亞單位陽性胃癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附是其腹部轉移的重要過程［9，13］。綜合以上，雖然ITGA1 rs2447867 多態(tài)性位點的功能尚待研究，但現(xiàn)有研究顯示ITGA1 在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，可以通過多個潛在的機制導致胃癌的發(fā)生。ITGA1rs2432143 位于ITGA1 基因內(nèi)含子1 內(nèi)，在韓國人群中報道該位點與胃癌的發(fā)病風險相關［7］，而該位點的功能目前還沒有相關報道。本研究沒有發(fā)現(xiàn)該位點與胃癌的發(fā)病風險相關，該位點目前還未見相關的研究報道，有待于今后的研究進一步證實。

表3 基因型分布及其與胃癌風險性的關系Tab.3 Genotypes distribution and it′s association with GC risk例（%）

rs1126643 是一個位于ITGA2 外顯子7 的C/T基因多態(tài)性，導致一個無義的多態(tài)性位點（Phe253Phe）?，F(xiàn)有研究提示該多態(tài)性位點也心血管疾病及阿司匹林藥效有關［14］。迄今為止，尚未見其與胃癌發(fā)病風險的相關性研究。rs3809865 與rs2675 分別位于ITGB3 基因ITGB5 基因的3′非編碼區(qū)（3′UTR）與基因的表達有潛在的相關性［15］，有研究報道二個位點與口腔鱗癌的發(fā)病風險相關［16］。rs17664 位點ITGA6 基因的3′UTR 區(qū)，有研究報道rs3809865，rs2675 及rs17664 而亦有研究報道這二個位點與胃癌的發(fā)病有潛在的相關性［17］，與本研究的結論不一致，這可能與研究的方法（該研究采用高分辨溶解曲線法）、納入研究的群體的年齡及地區(qū)（四川）的差別有關。上述研究結果目前鮮有研究報道，有待于進一步證實。

表4 ITGA1rs2447867 位點與胃癌風險的亞組分析Tab.4 Subgroup analysis of the assoication between ITGA1rs2447867 and GC risk

本研究還通過亞組分析進一步發(fā)現(xiàn)ITGA1-rs2447867 多態(tài)性位點與胃癌發(fā)病風險關系與年齡及胃癌的發(fā)生部位相關，該位點與在年齡較大人群（＞60 歲）的胃癌及與非賁門癌相關胃癌的發(fā)病風險相關。眾所周知，個體的年齡越大，所受到環(huán)境因素的影響積累就越多，這其中其中環(huán)境因素（如吸煙、飲酒、Hp 感染）、遺傳因素及其二者的相互作用是胃癌發(fā)病的重要原因［18-19］，隨著年齡的增長個體的環(huán)境暴露時間增加，此會導致個體的胃癌的發(fā)病風險增加。就胃癌的發(fā)病部位而論，有研究顯示賁門癌與非賁門癌在致病因素及分子表型方面有顯著的差異［20］，且二者在發(fā)病因素上亦有很大差異，如肥胖［21］、Hp 感染［22］等因素在二者發(fā)病的過程中起著不同的作用。此外，研究［23］還顯示，二類胃癌在免疫表型上有很大差異，非賁門癌的發(fā)生更傾向于與炎癥相關?；谖覈巳旱牧餍胁W調(diào)查顯示，既往患消化道潰瘍、慢性胃炎為非賁門癌最強的危險因素［24］，提示炎癥在非賁門癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而ITGA1 在介導炎癥過程發(fā)揮重要作用，以上結論與本研究ITGA1rs2447867 與非賁門癌發(fā)病風險相關的結果一致。

胃癌的發(fā)病因素復雜，本研究探討的ITGA1rs2447867 位點的功能尚沒有研究報道。另外，本研究所納入的病例還相對較少，這些都是本研究的薄弱之處。本研究的結果還有待于更大樣本量的分子流行病學研究及相關的功能研究的證實。

綜合以上，本研究結果顯示ITGA1rs2447867多態(tài)性位點與胃癌發(fā)病風險相關，且風險在年齡＞60 歲人群中增大，該位點與非賁門胃癌有更強的相關性。本研究的結論為胃癌發(fā)病的基礎研究提供了分子流病學資料，為胃癌發(fā)病的分子機制研究提供了臨床資料。