石婉婷 鄒榮軍 劉昭詩 文加玲 任江南 賴人旭

1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科內(nèi)鏡中心（廣東珠海519000）；2中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院心血管外科（廣州510120）；3中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院廣東省胃腸疾病研究所（廣州510655）

結(jié)腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一，是世界癌癥死亡的第三大原因，即時診斷及術(shù)后轉(zhuǎn)移率高達40%～50%［1］。而KRAS 是調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖及組織血管生成等過程的重要原癌基因［2］。正常的KRAS 基因參與腫瘤抑增殖、促凋亡等進程；一旦發(fā)生突變，則反向促進增殖、耐藥及惡性侵襲等［2-3］。此外，KRAS 突變還是結(jié)腸癌患者化療藥物不敏感及預(yù)后不良的獨立風(fēng)險因素；特別是在外顯子3、4 區(qū)域突變［3］。小泛素樣修飾蛋白-E2 連接酶（small ubiquitin-like modifier E2 ligase，UBE2I）是機體重要的泛素化結(jié)合酶，具有結(jié)合三磷酸腺苷及發(fā)揮泛素化蛋白轉(zhuǎn)移酶活力的功能，主要調(diào)控泛素依賴性蛋白分解代謝過程［4］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)UBE2I 通過小泛素（small ubiquitin-like modifier，SUMO）化修飾運動蛋白Ⅱ相關(guān)蛋白（KAP1）可調(diào)控腫瘤細胞Ras 基因的驅(qū)動與轉(zhuǎn)化，提示與腫瘤細胞的增殖侵襲密切相關(guān)［5］。在結(jié)腸癌研究領(lǐng)域，LIU 等［5］研究顯示UBE2I 通過SUMO 化修飾轉(zhuǎn)κB 及NFE2 轉(zhuǎn)座子區(qū)調(diào)控元件，激活c-myc 表達而參與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥形成等調(diào)控。MOSCHOS 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，UBE2I 在癌組織中的表達水平明顯增高，SUMO 化修飾底物顯著增加，且與結(jié)腸癌的Duke 分級正相關(guān)。然而，具體的調(diào)控機制尚未闡明。本研究擬觀察UBE2I在KRAS 突變型結(jié)腸癌中的表達及對增殖克隆的影響，以期為KRAS 突變型結(jié)腸癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人結(jié)腸癌細胞株HCT116、DLD1、RKO、HCT8［廣東省胃腸病研究所惠贈；突變分型參照通用軟件度量國際聯(lián)盟（COSMIC）標準（https：//cancer.sanger.ac.uk/cosmic）［7］；胎牛血清（Gibco 公司）；RPMI 1640（Thermo 公司）；TRIzol試劑（Life technologies 公司）；質(zhì)粒（Vigenebio 公司）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO 公司）；GoTaq?q-PCR試劑盒（Promega 公司）；一抗UBE2I、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔抗人多克隆抗體（Abcam 公司）；二抗羊抗兔多克隆抗體（碧云天公司）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）試劑盒（Sigma 公司）；ABI PRISM 7500 PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；連續(xù)多功能酶標儀（Thermo 公司）。

1.2 一般資料 下載癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中標準化后的結(jié)腸癌樣本表達譜及其對應(yīng)的臨床特征。該數(shù)據(jù)為結(jié)腸癌組織基于Illumina Hiseq 2000 RNA 測序平臺分析的測序數(shù)據(jù)（https：//xenabrowser.net/datapages/）［8］。去 除 未 明 確KRAS突變結(jié)果及測序數(shù)據(jù)與臨床特征信息不匹配的樣本后，最終，納入86 例樣本的癌組織及癌旁組織（距癌灶＜2 cm 的鄰近組織，病理證實無癌細胞）的測序表達值用于后續(xù)分析，其中KRAS 野生型37 例，KRAS 突變型49 例。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞株在37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中分別用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 基于短發(fā)夾RNA（shRNA）介導(dǎo)的方法沉默UBE2I，構(gòu)建含pLent-U6-GFP-Puro 的UBE2I 沉默質(zhì)粒（ShUBE2I）及空載質(zhì)粒（ShNC）。通過嘌呤霉素進一步篩選轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細胞，并通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time PCR，RTPCR）及Western Blot 在mRNA 及蛋白水平進一步驗證沉默效率。

1.5 RT-PCR 提取細胞總RNA，參照RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行反轉(zhuǎn)錄，依照GoTaq?q-PCR試劑盒的說明書在ABI PRISM 7500PCR 儀上進行Real-time PCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：模板預(yù)變性95 ℃（20 s）；PCR 反應(yīng)95 ℃（5 s）、60 ℃（20 s）共40 個 循 環(huán)，以2-ΔΔCt法計算UBE2I 的 相對表達量。引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。UBE2I 上游引物：5′-AGGCCAGCCATCACAATCAA-3′，下游引物：5′-TGTGCTCGGACCCTTTTCTC-3′。GAPDH 上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.6 Western Blot 收集細胞，裂解后離心，收集上清，15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，加入一抗（UBE2I 抗體1∶1 000；GAPDH 抗體1∶3 000），4 ℃過夜，加入二抗，37 ℃緩搖2 h，增強型化學(xué)發(fā)光劑（ECL）顯色成像。

1.7 CCK8及克隆平板實驗 取對數(shù)生長期細胞，以未處理組為對照組，以2.5 × 103個/孔的濃度接種至96 孔板，分別取第1、2、3、4、5 天換液，每孔加10 μL CCK8 試劑，孵育2 h 后，用酶標儀測波長450 nm 處的光密度（OD450）值，作為細胞活力。同樣地，將對數(shù)生長期的細胞以500 個/孔的濃度接種至4 孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)10 d，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，甲醇固定，0.005%結(jié)晶紫染色20 min，磷酸鹽緩沖液清洗2～3 遍，顯微鏡下計數(shù)直徑超過150 mm 的克隆群落。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。細胞實驗結(jié)果均進行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。組間和組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或方差分析；基因表達水平（高/低）與臨床特征關(guān)聯(lián)比較采用χ2檢驗或Fisher 精確概率檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2I 在KRAS 突變型結(jié)腸癌組織中的表達 UBE2I在KRAS突變型癌組織、KRAS突變型癌旁組織和KRAS 野生型癌組織在TCGA 中表達量分別為（11.47±0.24）、（10.76±0.15）、（10.50±0.05）。3者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=93.95，P＜0.01）；其中，與KRAS 突變型癌組織比較，KRAS 突變型癌旁組織和KRAS 野生型癌組織的UBE2I 表達量明顯下調(diào)（均P＜0.01）。細胞系RT-PCR 結(jié)果顯示，KRAS 野生型HCT8 細胞、RKO 細胞和突變型HCT116 細胞、DLD1 細胞的UBE21 mRNA 表達量分別為（1.02±0.10）、（1.24±0.13）、（2.34±0.19）、（1.94 ± 0.20）；4 者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=43.66，P＜0.01）；其中，與KRAS 野生型HCT8 細胞比較，突變型HCT116 和DLD1 的UBE21 mRNA 表達量均明顯上調(diào)（P＜0.01），而KRAS 野生型癌細胞RKO 細胞中的UBE21 mRNA 表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.13，圖1）。

圖1 UBE2I 在KRAS 突變型及野生型結(jié)腸癌組織及細胞中表達Fig.1 The expression level of UBE2I in KRAS mutant and wild-type colorectal cancer

2.2 KRAS 突變型結(jié)腸癌中UBE2I 表達水平與臨床病理特征關(guān)聯(lián)意義 以UBE2I 在所有KRAS 突變型樣本的表達值中位數(shù)為標準分成高低表達兩組。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)UBE2I 高表達與KRAS 突變型結(jié)腸癌的病理分級及臨床分期密切相關(guān)（P＜0.01；P=0.02），而與年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3 構(gòu)建shUBE2I 的KRAS 突變型結(jié)腸癌細胞對HCT116 及DLD1 兩株細胞轉(zhuǎn)染shUBE2I 及shNC空載質(zhì)粒后，觀察細胞熒光細胞占比（圖2A），利用RT-PCR 和Western Blot 檢測mRNA 及蛋白的表達變化。mRNA 及蛋白結(jié)果均顯示，3 者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中，與空白對照組比較，HCT116 及DLD1 細胞系shNC 組mRNA 相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而shUBE2I組mRNA 相對表達水平均明顯下調(diào)（P＜0.01）。Western Blot 水平，相對于空白對照組，shNC 組蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），而shUBE2I組蛋白表達水平明顯下調(diào)（P＜0.01，圖2）。

2.4 CCK8 及克隆平板實驗 CCK8 增殖實驗顯示，HCT116 細胞OD450值在組間處理和培養(yǎng)時間的交互效應(yīng)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 35.39，P＜0.01）；其中，與同時間點NC 組比較，shUBE2I 組在培養(yǎng)72、96、120 h 后對應(yīng)的細胞活性O(shè)D450值均明顯降低（P＜0.01）。同樣地，DLD1 細胞OD450值在組間處理和培養(yǎng)時間的交互效應(yīng)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=34.58，P＜0.01）；其中，與同時間點NC 組比較，shUBE2I 組在培養(yǎng)72、96、120 h 后對應(yīng)的細胞活性O(shè)D450值均明顯降低（P＜0.01）?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，在HCT116 細胞中shUBE2I 組、shNC組及NC 組克隆形成數(shù)目分別為（24.67 ± 1.53）、（41.00±2.01）、（46.33±6.50）；3 者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 23.57，P＜0.01）；其中，shUBE2I 組克隆球形成數(shù)目明顯低于shNC 組和NC 組（均P＜0.01）。在DLD1 細胞株中，3 組克隆球數(shù)目分別為（25.67±3.05）、（50.01±3.01）、（56.67±4.51）；3 者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 61.97，P＜0.01）；其中，shUBE2I 組克隆球形成數(shù)目明顯低于shNC 組和NC 組（均P＜0.01，圖3）。

表1 UBE2I 表達水平與KRAS 突變型結(jié)腸癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)Tab.1 The relationship between UBE2I expression level and clinical characteristics of KRAS mutant colorectal cancer

圖2 構(gòu)建shUBE2I 的KRAS 突變型結(jié)腸癌細胞及UBE2I 基因表達驗證Fig.2 The construction and validation of shRNA-mediated UBE2I gene silencing

3 討論

圖3 腫瘤細胞的平板克隆及CCK8 增殖實驗Fig.3 The clone formation and CCK8 proliferation experiments of KRAS mutant colorectal cancer cell

KRAS 突變型腫瘤細胞通過滅活表面受體及促進藥物外排等分子機制，可對抗靶向表皮生長因子受體（EGFR）的藥物反應(yīng)，導(dǎo)致不同的代謝特征和治療敏感性，并參與腫瘤惡性進展調(diào)控［4］。其中，KRAS 基因的突變與活化是參與惡性轉(zhuǎn)變及耐藥形成的重要的調(diào)控節(jié)點。質(zhì)譜定量實驗發(fā)現(xiàn)，KRAS 突變的腫瘤細胞中蛋白質(zhì)SUMO 水平明顯增高，KRAS 驅(qū)動及轉(zhuǎn)化也依賴與SUMO 樣修飾途徑［4，9］，提示SUMO 化與KRAS 相關(guān)信號的交互及調(diào)控是分子通路及藥物研究的重要機制。

UBE2I 是SUMO 化修飾過程中介導(dǎo)“共軛結(jié)合”的重要限速蛋白，在三維空間上具有“催化袋”樣結(jié)構(gòu)，能夠與底物中一系列特殊基團（如疏水殘基、賴氨酸、間隔子區(qū)域及酸性殘基）形成互補的拓撲結(jié)構(gòu)，是藥物研發(fā)的理想結(jié)構(gòu)［10-11］。目前研究提示，UBE2I 在肺腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等腫瘤中均顯著高表達，且與腫瘤大小、藥物敏感性及患者預(yù)后等密切相關(guān)［11-12］。腫瘤惡性進展中，UBE2I可能與ERK1/2 和p38 的激活調(diào)控、與內(nèi)在凋亡途徑交互作用及抑制免疫細胞浸潤等有關(guān)［13］。UBE2I 可能還參與了RAS 基因的轉(zhuǎn)錄與表達，與乳腺癌多重藥物耐藥性形成有關(guān)［4，14］；干擾敲除UBE2I 可明顯增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［14］。在結(jié)腸癌研究中，僅提示UBE2I 在癌組織中呈高表達差異，并與腫瘤肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，而未闡明具體的分子調(diào)控通路。雖然既往研究揭示了UBE2I對KRAS 基因驅(qū)動與轉(zhuǎn)化的潛在調(diào)控線索，但其對KRAS突變型結(jié)腸的具體調(diào)控機制未展開研究。

本研究結(jié)果提示：（1）相對于KRAS 野生型細胞及組織，UBE2I 在KRAS 突變型結(jié)腸癌中的表達水平明顯增高；（2）在KRAS 突變型結(jié)腸癌中UBE2I 高表達與腫瘤病理分級及臨床分期相關(guān)；（3）沉默KRAS 突變型結(jié)腸癌中UBE2I 表達可顯著降低腫瘤細胞的增殖及克隆能力。與既往研究相比，本研究首次探討了UBE2I 在KRAS 突變型結(jié)腸癌中的調(diào)控作用。一方面揭示了結(jié)腸癌組織中UBE2I 的差異表達水平及臨床意義；另一方面進一步闡述了其與KRAS 突變型結(jié)腸癌細胞增殖及克隆形成之間的交互關(guān)系，為KRAS 突變型結(jié)腸癌的分子機制及新藥研發(fā)提供潛在靶點。從國內(nèi)外研究來看，SUMO 化修飾與KRAS 突變之間的交互調(diào)控、結(jié)腸癌耐藥形成及結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移等過程可能還與癌組織免疫微環(huán)境的構(gòu)建有關(guān)［5-6，13，15］。因此，在以后的研究中，課題組將圍繞UBE2I 與KRAS 突變具體的調(diào)控通路及潛在的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開深入探索，從而明確UBE2I 在KRAS 突變型結(jié)腸癌中的具體調(diào)控作用，從而為此類“頑固性”結(jié)腸癌提供相應(yīng)的指導(dǎo)策略。