唐艷 鄧蘇辛

1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南衡陽421001）；2衡陽市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南衡陽421001）

阿霉素（adriamycin，ADR）是常見的抗腫瘤因子，因其心臟毒副作用，所以臨床應(yīng)用受到限制，而在其過程中心肌細胞（cardiomyocytes，CMs）凋亡為最主要的機制［1］。

各種干細胞條件培養(yǎng)液被開始應(yīng)用于心血管疾病并取得了很好的結(jié)果［2］。而在眾多干細胞中，內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一群能增殖、分化，暫未表達成熟血管內(nèi)皮細胞的特征性表型及形成血管的幼稚內(nèi)皮細胞，有促進血管新生和旁分泌功能，根據(jù)在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的時間分為早期和晚期EPCs，研究發(fā)現(xiàn)晚期EPCs 具有更強的旁分泌功能［3］。EPCs 因其取材方便，應(yīng)用價值大，近年來受到關(guān)注，然而關(guān)于晚期EPCs 與ADR 引起的CMs 凋亡之間的研究甚少，因此，本研究原代培養(yǎng)乳鼠CMs，建立ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡模型，同時制備晚期內(nèi)皮祖細胞條件培養(yǎng)液（endothelial progenitor cells conditioned medium，EPCs-CM），觀察晚期EPCs-CM 對ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 新生小牛血清，DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），Ⅱ型膠原酶，EDTA 胰酶（美國Sigma 公司），CD31 相關(guān)抗原抗體（北京博鰲生物技術(shù)公司），Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體（Solarbio，北京），鼠抗cTnI 多克隆抗體，兔抗TGF-β1 單克隆抗體（北京中杉金橋），RT-PCR 試劑盒（美國Fermentas 公 司），Hoechst33342/PI，AnnexinV-FITC/PI 及MTT 試劑盒（凱基生物），TRIzol Reagent（美國Invitrogen 公司），鹽酸阿霉素注射液（山西普德藥業(yè)），倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），電泳儀及垂直板蛋白電泳裝置（美國Bio-rad 公司）。

1.2 研究對象 1～3 d SD 乳鼠，體質(zhì)量7～11 g，雌雄不限；8～12 周健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量170～240 g，由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.3 EPCs 分離、培養(yǎng)及鑒定 頸椎脫臼法處死大鼠，無菌取出股、脛骨，沖洗骨髓腔，離心收集細胞，DMEM 培養(yǎng)基（含10%新生小牛血清）反復(fù)吹打制成細胞懸液，放置在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。2 d 后全量換液，離心，上懸液接種于人纖維粘連蛋白預(yù)包被的6 孔細胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d 換液，傳代培養(yǎng)至28 d，免疫熒光顯微鏡檢測EPCs 表面標(biāo)志CD31、Ⅷ因子的表達進行鑒定。

1.4 晚期EPCs-CM 制備 培養(yǎng)28 d 收集晚期EPCs 的上清液，以2 000 r/min 離心10 min 離心棄細胞碎片，于-20 ℃保存。

1.5 CMs 原代培養(yǎng) 無菌取出乳鼠心臟，剪碎，加入0.1%胰酶及0.1%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合反復(fù)消化，細胞懸液先用200 目篩網(wǎng)過濾，離心收集CMs，培養(yǎng)基（含20%新生小牛血清）反復(fù)吹打制成細胞懸液，差速貼壁1 h 分離并棄成纖維細胞，以獲得較純的CMs，放置在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。鼠抗心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnI）多克隆抗體，鑒定CMs。

1.6 實驗分組與干預(yù) 分為對照組，模型組及實驗組；對照組為原代培養(yǎng)CMs 108 h；模型組為原代培養(yǎng)CMs 48 h 后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，后換等量的含ADR（5 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；實驗組為原代培養(yǎng)CMs 48 h 后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，后換等量的含ADR（5 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基及晚期EPCs-CM，培養(yǎng)4、24、48 h 分別用MTT 法檢測各組CMs 存活率，48 h 后3 組均檢測CMs 凋亡率，測定BNP 和TGF-β1 的mRNA 及蛋白的表達。

1.7 MTT 法 將各組CMs 以1 × 104個細胞接種至96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，每孔加入50 μL 1×MTT，繼續(xù)37 ℃孵育4 h 后吸出上清液，再加入150 μL DMSO，低速搖勻，酶標(biāo)儀在550 nm波長處檢測每組的光密度（OD），將各測試孔的OD值減去調(diào)零孔OD值（調(diào)零孔是完全培養(yǎng)基加MTT），復(fù)孔的OD值取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，細胞存活率（%）=（實驗組細胞OD/正常組細胞OD-1）×100%，以作用時間為橫坐標(biāo)，細胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細胞存活率曲線。

1.8 Hoechst33342/PI 法 取各組CMs 消化收集后，將105～106個細胞懸浮于1 mL 培養(yǎng)基中，加入Hoechst 33342 染液10 μL，混勻，37 ℃孵育10 min，于4 ℃，1 000 r/min 離心5 min棄上清液，再加入1 mL 1 × Buffer A 工作液懸浮細胞，后再加入PI 染液5 μL，室溫，避光，反應(yīng)10 min 后，熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)正常細胞和凋亡細胞，凋亡指數(shù)=凋亡細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.9 AnnexinV-FITC/PI 法 取各組CMs 用不含EDTA 的胰酶消 化 收 集，用PBS 洗滌2 次，2 000 r/min 離心5 min 收集1～5 × 105的CMs，用Binding Buffer 500 μL 懸浮細胞，向其加入Annexin V-FITC液5 μL，混勻，后再加入PI 染液5 μL，室溫、避光、反應(yīng)10 min；1 h 內(nèi)，用流式細胞儀以激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm 進行觀察，計算CMs凋亡指數(shù)。

1.10 qRT-PCR 法 各組CMs 按產(chǎn)品說明書用Trizol Reagent 裂解，抽取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，條件為65 ℃5 min，25 ℃5 min，42 ℃60 min，70 ℃5 min，保存于-70 ℃。以20 μL 的反應(yīng)體系進行PCR，取2 μL 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物分別與BNP，TGF-β1 及內(nèi)參GAPDH 引物進行反應(yīng)；BNP引物序列：上游：5′-TGATTCTGCTCCTGCTTTTC-3′；下游：5′-GTGGATTGTTCTGGAGACTG-3′；TGFβ1：上游：5′-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3′；下游：5′-TCAAAAGACAGCCACTCAGG-3′；GAPDH：上游：5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′；下游：5′-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；反應(yīng)條件：BNP：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 個循環(huán)；產(chǎn)物140 bp；TGF-β1：預(yù)95 ℃變性1 min，95 ℃變性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 個循環(huán)。產(chǎn)物280 bp；GAPDH：94 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)，最后再72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物251 bp。取10 μL PCR 產(chǎn)物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)拍照，目的產(chǎn)物的相對表達量為目的產(chǎn)物/GAPDH 產(chǎn)物電泳條帶密度的比值，引物由上海捷瑞公司提供，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析。

1.11 Western Blot檢測 各組CMs按總蛋白提取試劑盒說明書進行，用細胞刮收集，4℃，12 000 r/min離心10 min 獲得總蛋白，取10 μL 蛋白溶液在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，先恒壓電泳80 V，待溴芬藍條帶前端進入分離膠約10 min 后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)恒壓電泳，當(dāng)條帶前端跑至分離膠底部，停止電泳，以0.8～3.0 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)膜1～2 h，將NC 膜取出后放入5%脫脂奶粉/TBS-T 液中4 ℃封閉1 h，再放入一抗（兔抗BNP 多克隆抗體1∶500，兔抗TGF-β1 單克隆抗體1∶500，1∶1 000 鼠抗β-actin多克隆抗體）中，孵育4 ℃過夜，再用TBS-T液洗膜共3 次，每次5 min，再放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔，羊抗鼠二抗（1∶5 000）中，4℃孵育4 h，后用TBST 液洗膜共3 次，每次10 min；ECL 發(fā)光試劑盒顯色，顯影，用圖像處理系統(tǒng)拍照并分析。目的蛋白相對表達值為目的蛋白/內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，多組間比較采用ANOVA 檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs 的培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)2 d后大部分EPCs貼壁，呈圓形，體積較小；第4～7 天，細胞體積增大，呈梭形，形成集落，第8～10 天貼壁細胞逐漸增多，呈微血管樣生長。第28 天，呈現(xiàn)“鋪石路”樣的晚期EPCs（圖1）。免疫熒光顯示：EPCs特征性標(biāo)志物CD31、VIII 陽性細胞率高，約90%（圖2）。

圖1 培養(yǎng)的EPCs 形態(tài)學(xué)變化（×100）Fig.1 Morphological changes of the cultured endothelial progenitor cells（×100）

圖2 EPCs 特征性標(biāo)志物CD31 及VIII 因子的免疫熒光鑒定（×100）Fig.2 Immunofluorescence identification of characteristic marker CD31 and VIII factor of endothelial progenitor cells

2.2 CMs 的培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)第1 天后見大部分CMs 呈梭形生長，集落樣分布，可見非同步性搏動。第3 天CMs 搏動較前明顯有力，呈同步性搏動，頻率60～170 次/min（圖3）。免疫熒光結(jié)果：CMs 的特征性標(biāo)志物cTnI 陽性細胞率高，80%以上（圖4）。

圖3 原代培養(yǎng)乳鼠CMs 形態(tài)學(xué)變化（×100）Fig.3 Morphological changes of the primary cultured neonatal rat cardiomyocytes

2.3 晚期EPCs-CM 對ADR 誘導(dǎo)的CMs 存活率及凋亡率的影響 MTT 檢測CMs 存活率：同一作用時間，與對照組相比，模型組的CMs 存活率較對照組降低，實驗組的存活率較模型組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同一組不同作用時間相比，4 、24 及48 h 的CMs 存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，存活率隨著作用時間的延長逐漸降低，其中作用48 h差異最明顯（P＜0.05）。因而選擇作用48 h 為最佳觀察點，觀察后續(xù)CMs 凋亡及相關(guān)基因蛋白的檢測（圖5）。

圖4 CMs 特征性標(biāo)志物cTnI 的免疫熒光鑒定（×100）Fig.4 Immunofluorescence identification of characteristic marker cTnI of cardiomyocytes

圖5 MTT 法檢測各組CMs 存活率Fig.5 Detection of cardiomyocytes survival rate in each group by MTT

AnnexinV-FITC/PI 法檢測結(jié)果：對照組、模型組及實驗組凋亡指數(shù)分別為：（7.22 ± 0.21）%、（59.33±0.83）%、（15.19±0.92）%；與對照組相比，模型組的CMs 的凋亡指數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組的凋亡指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

Hoechst33342/PI 法檢測結(jié)果：對照組、模型組及實驗組的CMs凋亡指數(shù)分別為：（7.21±0.15）%、（58.83±0.74）%、（15.77±0.18）%。與對照組相比，模型組的CMs 的凋亡指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，實驗組的凋亡指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖7）。

圖6 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測各組CMs 凋亡率Fig.6 Detection of cardiomyocytes apoptosis rate in each group by AnnexinV-FITC/PI double staining

圖7 Hoechst33342/PI 雙染法檢測各組CMs 凋亡率（×400）Fig.7 Detection of cardiomyocytes apoptosis rate in each group by Hoechst33342/PI double staining

2.4 各組CMs 的BNP 和TGF-β1mRNA 的相對表達量 2-△△Ct計算結(jié)果顯示，同對照組相比，模型組的CMs 的BNP mRNA 相對表達量是對照組的0.32 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同模型組相比，實驗組的BNP mRNA 相對表達量為模型組的0.68 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同對照組相比，模型組的CMs 的TGF-β1 mRNA 相對表達量是對照組的3.6 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同模型組相比，實驗組的TGF-β1 mRNA 相對表達量為模型組的0.54 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖8）。

圖8 各組CMs 的BNP 及TGF-β1 mRNA 的相對表達量Fig.8 Relative expression of BNP and TGF-β1 mRNA in the cardiomyocytes of each group

2.5 各組CMs 的BNP 和TGF-β1 蛋白的相對表達量 同對照組相比，模型組的CMs 的BNP 蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同模型組相比，BNP 蛋白在實驗組中表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同對照組相比，模型組的CMs 的TGF-β1 蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同模型組相比，TGF-β1 蛋白在實驗組中表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖9）。

3 討論

圖9 各組CMs 的BNP 及TGF-β1 蛋白的相對表達量Fig.9 Relative expression of BNP and TGF-β1 protein in the cardiomyocytes of each group

ADR 是一個有效的抗實體瘤和惡性血液病的化療藥物，而心功能障礙是ADR 治療最嚴(yán)重的副作用，因而使用受到限制。目前越來越多證據(jù)證實ADR 誘導(dǎo)的心肌病的過程中存在大量的機制，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細胞損傷、CMs 凋亡等，其中CMs 凋亡可能扮演了關(guān)鍵的角色［1］。本研究利用ADR 誘導(dǎo)CMs 凋亡模型作為研究的切入點，尋找能逆轉(zhuǎn)其CMs 凋亡的有效方法及機制探討。

3.1 晚期EPCs-CM 對ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡的影響 EPCs 是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，EPCs 主要存在于骨髓，當(dāng)在缺血、血管損傷等因素的誘導(dǎo)下，可從骨髓動員到外周血，參與損傷血管的修復(fù)，在冠心病、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等血管性疾病中發(fā)揮治療作用［2］，近年來研究發(fā)現(xiàn)EPCs移植同樣應(yīng)用于心肌病如糖尿病心肌病、藥物性心肌病等［4-5］。研究［3］證實：EPCs 除了具有新生血管功能外，其許多心血管的作用是通過旁分泌功能所實現(xiàn)的，而檢測EPCs的旁分泌功能的方法就是將細胞X的條件培養(yǎng)液作用于細胞Y，觀察其對細胞Y 相關(guān)功能的影響，WU 等［6］研究發(fā)現(xiàn)晚期EPCs 可分泌多種具有抗凋亡因子。HYNES 等［7］發(fā)現(xiàn)EPCs-CM 能通過調(diào)控胰島素類似生長因子-1 的表達在急性心肌梗死后心臟重構(gòu)中發(fā)揮抗CMs凋亡的作用。HANEEF 等［8］發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能通過促進心臟血管再生在缺血性心肌病中發(fā)揮一定的治療作用。本研究培養(yǎng)EPCs 28 d 后取其上清液作為晚期EPCs-CM，將其作用于ADR誘導(dǎo)的CMs凋亡模型中，MTT法、Hoechst33342/PI及AnnexinV-FITC/PI 雙染法發(fā)現(xiàn)ADR 能明顯降低CMs 的存活率及增加CMs凋亡率，而晚期EPCs-CM能抑制ADR誘導(dǎo)的CMs凋亡，提高CMs的存活率，在體外實驗上初步揭示晚期EPCs-CM 可能能在ADR 誘導(dǎo)的心肌病上發(fā)揮一定的治療作用。

3.2 在晚期EPCs-CM 作用于ADR 誘導(dǎo)的CMs凋亡上TGF-β1 的表達的變化 在心衰發(fā)生發(fā)展的過程中，CMs 能產(chǎn)生一系列細胞因子，通過自分泌或旁分泌，在特定的條件下，經(jīng)特定的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控心衰的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β是在心衰發(fā)展過程中急劇增加的細胞因子中的一員，TGF-β1 作為TGF-β超家族中重要亞型，生物學(xué)功能復(fù)雜，尤以介導(dǎo)CMs 凋亡的功能為主［9］。本研究發(fā)現(xiàn)ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡模型中，CMs 的TGF-β1 mRNA 及蛋白表達明顯上調(diào)，而晚期EPCs-CM 可明顯下調(diào)凋亡因子TGF-β1 mRNA 及蛋白的表達，提示晚期EPCs-CM 可能是通過下調(diào)TGF-β1的表達抑制ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡。

3.3 在晚期EPCs-CM 作用于ADR 誘導(dǎo)的CMs凋亡上BNP 的表達的變化 BNP 作為一種神經(jīng)激素，其分泌和釋放受CMs 張力影響，在心衰的病理生理過程發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在動物體內(nèi)注射ADR 后其血漿BNP 濃度上升，血漿BNP 可作為ADR心肌病的監(jiān)測指標(biāo)［10］。本研究應(yīng)用5 μg/mL的ADR 建立CMs 凋亡模型模擬體外ADR 性心肌病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMs 的BNP mRNA 轉(zhuǎn)錄沒有增加反而被抑制，Western Blot檢測也進一步證實BNP蛋白表達減少，這與體內(nèi)實驗于動物體內(nèi)應(yīng)用ADR 引起的BNP 濃度升高的結(jié)論相悖，考慮可能為體外一次性使用ADR 作用于CMs 后其急性毒性作用能引起B(yǎng)NP的表達暫時減少，而分次給動物體內(nèi)應(yīng)用ADR是一個劑量逐漸累積引起慢性毒性效應(yīng)，導(dǎo)致心功能受損，心室負荷增加，從而引起B(yǎng)NP 表達分泌增加。本研究同時發(fā)現(xiàn)在ADR 誘導(dǎo)的CMs 凋亡模型中應(yīng)用晚期EPCs-CM 能明顯上調(diào)BNP mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達，提示晚期EPCs-CM可能是通過上調(diào)BNP的表達抑制ADR誘導(dǎo)的CMs凋亡。

綜上所述，筆者認為晚期EPCs-CM 能抗ADR誘導(dǎo)的CMs 凋亡，其機制可能是通過下調(diào)凋亡因子TGF-β1 的表達及上調(diào)BNP 的表達所實現(xiàn)的，晚期EPCs 移植未來可能可用于ADR 誘導(dǎo)的心肌病的預(yù)防和治療，甚至也可預(yù)防其他蒽環(huán)類藥物抗腫瘤時對心肌的損害。然而晚期EPCs抗CMs凋亡機制復(fù)雜，且WU 等［6］研究結(jié)果已經(jīng)提示多種細胞因子都可能對其起作用。受研究條件所限，本實驗僅研究了其中的BNP 及TGF-β1，對于相關(guān)機制的探索，還有待于深入研究。本研究目前僅局限于體外細胞實驗，動物實驗及人體臨床試驗尚未開展，此研究為干細胞治療心血管疾病提供前期基礎(chǔ)。