杭月 林昌岫 黃成日

延邊大學附屬醫(yī)院1婦產科，2中心實驗室（吉林延吉133000）

神經鞘磷脂（sphingomyelin，SM）是脂質筏的重要成分［1］，有希望成為腫瘤診斷和治療的新靶標。神經鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）是SM 合成的最后一個酶，包含SMS1 和SMS2兩個同工酶。SMS1 參與SM 的生物合成，而SMS2與SM 合成后的加工修飾有關，是影響細胞內SM、神經酰胺（ceramide，Cer）等細胞因子活性和濃度的關鍵酶，同時也是炎癥反應中重要的調控因子［2］。由于有研究證實，SMS1 缺失后對癌細胞的影響作用并不明顯，所以選擇性的SMS1 抑制劑并不能作為理想的細胞毒性藥物用于臨床［3］。而下調SMS2 的表達可影響脂質筏的功能，進而抑制細胞的凋亡［4］。另外，已知腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）可通過激活酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）降解SM 而生成Cer，誘導細胞凋亡［5］。為進一步證明SMS2 與腫瘤細胞亡的關系，筆者擬以人乳腺癌細胞株MCF-7 為實驗模型，用TNF-α誘導凋亡后，將SMS2 siRNA 轉染至細胞中，探討SMS2 基因沉默后對MCF-7 細胞凋亡的影響，從而為臨床治療和藥物研發(fā)提供潛在的靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人雌激素受體陽性乳腺癌細胞株MCF-7 由延邊大學病理學教研室提供并傳代保存。將MCF-7 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。

1.2 MTT 法檢測細胞增殖 將對數期生長的MCF-7 細胞（1×104/孔）單層接種至96 孔板中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，加入不同梯度濃度的TNF-α（50、100、200、400、800 ng/mL），孵育48 h 后，每孔加入20 μL MTT，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄除上清液，每孔加入200 μL DMSO，置于振蕩器上震蕩5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物。將96 孔板放置于酶標儀上，檢測波長為570 nm 處的光密度值（OD值），計算細胞增殖抑制率和IC50：增殖抑制率（%）=1-OD值（受試孔）/OD值（對照空）×100%，每組取8 個復孔平均值。

重復上述實驗，取IC50濃度的TNF-α分別作用于細胞24、48、72、96 h，檢測波長為570 nm 處的光密度值（OD值），計算細胞增殖抑制率。

1.3 構建SMS2 siRNA轉染細胞株 用DEPC水稀釋SMS2 siRNA 至終濃度為20 μmol/L。取適量的SMS2 siRNA 加入至Opti-MEM 轉染培養(yǎng)基中，輕輕混勻。再取適量的LipofectamineTM2000 與之混合，室溫下孵育約20 min，形成siRNA-LipofectamineTM2000 復合體。于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色判斷感染率。提前1 d 在相應備行轉染的6 孔板上接種5 × 105個細胞，加入不含FBS 和雙抗的培養(yǎng)基400 mL 至培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)3 h，隨后加入10%FBS 和TNF-α（終濃度IC50）培養(yǎng)24 h 后，待融合率達到50%～60%時，再加入適量脂質體復合體，使SMS2 siRNA 終濃度為100 nmol/L。置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。提取細胞RNA 及蛋白，驗證目的基因表達情況及轉染效率。實驗分為4 組：空白對照組（CTL 組）、TNF-α組、陰性對照組（SiR-Con 組）和轉染組（SiR2 組）。

1.4 酶活性檢測 收集對數期生長的MCF-7 細胞（1 × 107個），加入勻漿液置于冰浴中，取出勻漿粗酶液100 μL 加入SMS 反應體系（取100 μL 粗酶液、60 mL 勻漿液、425 μL 雙蒸水、3 μL PC、2 μL NBD-Cer，37 ℃反應5 h）中，37 ℃反應5 h，加入900 μL 氯仿-甲醇（2∶1）溶液，充分震蕩混勻后，離心并提取有機相，氮氣干燥，用薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）測定SMS 酶活性。

1.5 Hoechst33258/PI 雙染法觀察活細胞狀態(tài)將各組細胞（1 × 104個/孔）單層接種至24 孔板中正常培養(yǎng)，每組設置8 個平行孔，加入預冷的PBS洗滌3 次，每孔加入濃度為5 μg/mL 的Hoechst 33258 染液200 μL，37 ℃避光孵育15 min，隨后每孔加入濃度為15 μg/mL 的PI 染液50 μL，4℃避光孵育15 min，采用高內涵活細胞成像系統(tǒng)觀察細胞凋亡形態(tài)。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，采用預冷的PBS 洗滌3 次后，3 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清；加入500 μL Binding Buffer重懸，加入Annexin V 5 μL，避光孵育15 min；加入PI 5 μL，4 ℃避光孵育15 min；3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清；加入300 μL 結合緩沖液；上機檢測。所有操作嚴格按照試劑盒說明書操作進行。采用流式細胞儀（Ex=488 nm，Em=530 nm）檢測細胞凋亡情況。

1.7 熒光定量實時PCR （1）采用Trizol 法提取細胞總RNA；按照RNA 提取試劑盒說明書提供的步驟進行操作，采用分光光度計檢測RNA 濃度。（2）以細胞cDNA 為模板，以β-actin 作為內參。將10 μL 反應體系置于37 ℃恒溫水浴20 min，85 ℃5 s，將反應生成的cDNA 放于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）冰浴中配制20 μL PCR 反應體系，95 ℃30 s 預變性，95 ℃5 s 退火，60 ℃20 s 延伸，循環(huán)40 次，95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s 終末延伸，4 ℃保存。引物序列如下：鼠抗B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（F：5′- CATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3′；R：5′-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3′）；鼠抗Bcl-2 相關X 蛋白（bcl-2-associated X protein，Bax）（F：5′-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′；R：5′-CAGCCTTGAGCACCAGTTTG-3′）；caspase-3（F：5′-CTGGGAAGGGTTGTGAATGA-3′；R：5′-CAGTTTGGCTTGCTGGTCTC-3′）。根據使用說明調整基線，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相對表達量。

1.8 免疫印跡法（Western Blot） 收集對數期生長的MCF-7 細胞1 × 107個，加入預冷PBS，清洗3 次；加入RIPA 細胞裂解液，收集上清；測定蛋白濃度。加入SDS 上樣緩沖液充分混勻，置于95 ℃水浴中10 min，使蛋白變性。將10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離蛋白轉移方法轉移到PVDF 膜上并浸入密封液中1 h。沖洗，分別加入Bcl-2 抗體（1∶500 稀釋）、Bax 抗體（1∶500 稀釋）、caspase-3 抗體（1∶1 000 稀釋），置于4 ℃搖床上過夜。采用TBST 沖洗3 次，加入二抗（1∶5 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，洗膜，顯影5 min，采用Alpha 凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠光密度值。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行處理；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α 對MCF-7 細胞增殖活性的影響 經MTT 法檢測，不同濃度TNF-α 對MCF-7 細胞增殖的抑制率分別為（9.86±1.38）%、（15.41±3.77）%、（36.28±7.15）%、（58.34±6.86）%、（64.78±7.45）%，IC50為205.7 ng/mL（圖1）。

圖1 經MTT 法檢測TNF-α 對MCF-7 細胞增殖活性的影響Fig.1 Proliferation of MCF-7 cells induced by TNF-α by MTT assay

2.2 Si-SMS2 慢病毒轉染效果 慢病毒按感染復數（multiplicity of infection，MOI；MOI=病毒數量/細胞數量）為50 時轉染效率較高，細胞狀態(tài)良好。經qRT-PCR 法檢測，SiR2 組細胞SMS2 mRNA 表達水平明顯低于CTL 組和SiR-Con 組，差異有統(tǒng)計學意義（F= 49.75，P＜0.000），基因表達水平分別下降62.5%和64%（圖2）。

2.3 SMS 酶活性測定 經凝膠圖像分析儀掃描，CTL 組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組SMS 酶活性灰度值分別為（18.17±3.78）、（12.26±3.15）、（11.53±3.65）、（4.35±1.29），經TNF-α誘導后，TNF-α組、SiR-Con組以及SiR2組細胞SMS酶活性灰度值均低于CTL 組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細胞SMS 酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 MCF-7 細胞轉染SMS2 siRNA 后SMS2 mRNA 表達情況Fig.2 SMS mRNA levels of MCF-7 cells transfected with SMS2 siRNA

圖3 基因沉默后SMS 酶活性比較Fig.3 Changes of SMS activity after RNA interference

2.4 MCF-7 細胞凋亡情況

2.4.1 經Hoechst33258/PI 雙染法觀察各組活細胞狀態(tài) 如圖4A 所示，活細胞為藍色，而壞死細胞核呈紅色并腫大，凋亡細胞可見細胞核染色質凝聚、皺縮、致密的紅色或亮藍色。CTL 組可見正常細胞的有絲分裂，而TNF-α組、SiR-Con 組和SiR2組細胞出現明顯的凋亡和壞死，尤其是SiR2 組細胞紅色標記細胞明顯多于其他3組。CTL組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組細胞凋亡率分別為（3.11 ±0.69）%、（14.29 ± 2.71）%、（13.85 ± 1.96）%、（31.08± 5.46）%，細胞壞死率分別為（0.63 ± 0.12）%、（1.72 ± 0.38）%、（1.65 ± 0.40）%、（3.75 ± 0.47）%，經TNF-α誘導后，TNF-α組、SiR-Con 組以及SiR2 組細胞凋亡率和壞死率均高于CTL 組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con組相比，SiR2 組細胞凋亡率和壞死率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4B、4C）。

圖4 Hoechst33258/PI 雙染法觀察各組細胞凋亡率和壞死率Fig.4 Apoptosis and death rates of MCF-7 cells observed by Hoechst33258/PI staining

2.4.2 FITC-annexin V/PI 雙染法觀察各組細胞凋亡情況 經FCM 法檢測（圖5A），CTL 組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組細胞凋亡率分別為（7.15 ±2.14）%、（21.46 ± 5.72）%、（23.05 ± 7.28）%、（39.57±7.35）%，經TNF-α誘導的3組細胞，TNF-α組、SiRCon 組以及SiR2 組細胞凋亡率均高于CTL 組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細胞凋亡率進一步增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5B。

2.5 SMS2 基因沉默對MCF-7 細胞凋亡相關基因和蛋白表達的影響

2.5.1 qRT-PCR 法檢測 如圖6A 所示，經TNF-α誘導后，TNF-α組、SiR-Con組以及SiR2組細胞Bcl-2基因表達量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3基因表達量均高于CTL 組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細胞Bcl-2 基因表達量進一步降低，Bax 和caspase-3 基因表達則進一步上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5.2 Western Blot 檢測 如圖6B 所示［1］，與qRTPCR法檢測結果基本一致，經TNF-α誘導后，TNF-α組、SiR-Con 組以及SiR2 組細胞Bcl-2 蛋白表達量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3 蛋白表達量均高于CTL 組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細胞Bcl-2蛋白表達量進一步降低，Bax 和caspase-3 蛋白表達則進一步上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

HAMPTON 等［6］首次發(fā)現可溶性神經鞘磷脂與細胞信號轉導密切相關。尤其是Cer 作為神經鞘磷脂家族最重要的成員之一，既是細胞膜的主要組成成分，也是細胞凋亡、增殖、活化等過程的重要參與者。而與催化Cer 相關的關鍵酶SMS 也逐漸引起眾多學者的關注。近幾年，有研究發(fā)現SMS 活性改變可能與細胞凋亡有關。SMS 包含SMS1 和SMS2 兩種同工酶，細胞內SMS2 缺乏可以明顯降低SMS 酶活性以及細胞內SM 的水平［7］。

圖5 流式細胞術檢測SMS2 基因沉默對MCF-7 細胞凋亡的影響Fig.5 Apoptosis of MCF-7 cells by flow cytometry

圖6 SMS2 基因沉默對MCF-7 細胞凋亡相關基因和蛋白表達的影響Fig.6 The mRNA and protein levels of apoptosis-related factors

本研究首先通過MTT 法檢測不同濃度梯度的TNF-α對MCF-7 細胞凋亡的促進作用，最終選擇IC50濃度即205.7 ng/mL 作為后續(xù)研究的作用濃度。TNF-α是由活化的單核巨噬細胞分泌產生的一類最重要的細胞因子，作用機制復雜，對乳腺癌細胞呈現雙向調控作用［8］。在體外可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖，促使其凋亡；而在體內則可通過調控機體免疫功能以及促炎性反應等，促使腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡［9］。最新有研究證實TNF-α可通過激活酸性神經鞘磷脂降解鞘磷脂，從而生成Cer，誘導細胞發(fā)生凋亡［10］。因此本項研究旨在分析SMS2 基因沉默對TNF-α誘導MCF-7 細胞體外凋亡實驗的影響。

既往報道稱，SMS 基因異常表達不僅影響SMS酶活性，對細胞和培養(yǎng)基中SM 的水平也有一定的調節(jié)作用［11］。本研究也發(fā)現，下調SMS2 基因表達后，MCF-7 細胞內SMS 酶活性顯著降低。同時出現典型的細胞凋亡特征，與空白MCF-7 細胞組或者單純TNF-α誘導組相比，si-SMS2 組細胞凋亡率進一步增加。因此，筆者推測沉默MCF-7 細胞SMS2 基因表達后，細胞內SMS 酶活性降低，底物Cer 利用率隨之下降，而剩余的Cer 水平也相應升高，Cer 作為公認的促凋亡信號分子，可能與多種信號通路調節(jié)或凋亡相關蛋白的表達有關。隨后筆者進一步證實，經TNF-α誘導后，TNF-α組、SiRCon 組以及SiR2 組細胞Bcl-2 基因表達量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3 基因表達量均高于CTL組細胞，并且與TNF-α組、SiR-Con組相比，SiR2組細胞Bcl-2 基因表達量進一步降低，Bax 和caspase-3基因表達則進一步上調。據判斷，SMS2 作為催化卵磷脂和Cer 生成SM 和甘油二酯的關鍵酶，其表達下調，則底物Cer 水平相應增加，DAG 和SM水平隨之減少。作為細胞內重要的第二信使，Cer和DAG 均與凋亡酶系統(tǒng)、線粒體凋亡途徑等密切相關［12］。其中Bcl-2 蛋白家族和caspase 家族是目前最受關注的、作用最為確切的凋亡調控基因。Bcl-2 家族蛋白屬于抗凋亡因子，主要通過調節(jié)細胞色素C 的釋放來促進Bax 或抑制Bcl-2 誘導細胞凋亡［13］。當抗凋亡基因Bcl-2 表達上調時，Bcl-2與Bax 形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡。而caspase-3是多種凋亡途徑共同的下游調控蛋白，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”［14］。而近年來關于Bcl-2、Bax、caspase-3 三者的關系研究也發(fā)生了突破性進展，發(fā)現Bcl-2、Bax 不僅是caspase-3 的上游調控基因，同時也是caspase-3 的直接作用底物，三者既相互聯系，又相互制約［15］。因此，通過本項研究說明SMS2 基因沉默后細胞凋亡作用與死亡受體通路和線粒體途徑均密切相關。

綜上所述，通過體外細胞實驗證實，乳腺癌細胞脂質筏中SMS2 基因缺失與促使細胞凋亡有關。SMS2 基因沉默可降低細胞內SMS 酶活性，通過抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表達，同時上調促凋亡基因Bax 和caspase-3 的表達水平，提高TNF-α誘導腫瘤細胞凋亡的作用，因此及SMS2 基因表達調控可成為乳腺癌化療藥物的重要干預靶點。但是本項研究只是初步證明SMS2 基因沉默與乳腺癌細胞的凋亡存在一定的聯系，如證實這個具體的作用機制，還需要納入更多的腫瘤細胞進行進一步深入且細致地研究。