張佳恒, 馬利紅, 應朝福

(浙江師范大學 信息光學研究所,浙江 金華 321004)

0 引 言

由于生物細胞的細胞質(zhì)和大部分細胞器的光學吸收系數(shù)很小，幾乎無色透明，因此,傳統(tǒng)明場顯微圖像通常對比度很低，很難觀察到有用的細胞細節(jié).生物細胞結(jié)構(gòu)特征及各組分不同的折射率分布對于入射光波最直接的影響就是產(chǎn)生不同的相位延遲，即相移.澤尼克相襯顯微[1]與微分干涉相襯顯微技術(shù)[2]作為最常用的相位成像方法，可將相移差異轉(zhuǎn)換為圖像的強度對比，大大提高了細胞等弱吸收樣品的圖像襯度.但是這2種方法只是將相移分布定性地轉(zhuǎn)化成了圖像的強度分布，不能用于細胞的定量測量.隨著生命科學與生物醫(yī)學研究的不斷深入，生物學家們也越來越意識到定量測量細胞和組織中的相位分布特性對于細胞顯微觀察、結(jié)構(gòu)信息提取及動力學行為研究的重要性.因此，定量相位顯微技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展已成為必然趨勢.

白光衍射定量相位顯微術(shù)[3-5]是一種基于白光干涉的定量相位成像技術(shù)，可以精確地獲取樣品的高分辨率相位信息.該技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢：從光源上看，采用白光作為照明光源，其相干長度非常短，小于1 μm，因此,可以避免由光源強相干性產(chǎn)生的相干噪聲及寄生條紋噪聲[6-7]；從結(jié)構(gòu)上看，采用共路結(jié)構(gòu)，由于其物光和參考光共路的特性，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抗干擾能力強的優(yōu)點[8-10]；從記錄方式上看，利用光柵衍射與4f系統(tǒng)實現(xiàn)離軸記錄，具有離軸干涉成像的優(yōu)勢，可以從單張干涉圖獲取物體相位信息，實時記錄細胞的動態(tài)變化過程.因此，白光衍射定量相位顯微術(shù)已得到廣泛的研究與關(guān)注.

為了實現(xiàn)生物活體細胞的高分辨率定量相位成像，筆者設計并組建了一套倒置式白光衍射顯微相位成像系統(tǒng).系統(tǒng)的空間成像噪聲低于0.60 nm，時間成像噪聲低于0.04 nm.首先用標準樣品驗證了系統(tǒng)測量的準確性；然后以活體血紅細胞與大腸桿菌細胞為樣品，獲得了準確的定量相位像；最后對霉菌孢子進行了長時間的成像記錄，獲得了其在水中萌發(fā)的動態(tài)定量相位像.實驗結(jié)果表明，系統(tǒng)成像精度高，且具有長時間觀察生物活細胞的能力.

1 白光衍射顯微相位成像基本原理

圖1 白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)光路原理圖

組建的白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)的光路原理如圖1所示，它是在倒置式明場光學顯微鏡的基礎上附加了一個4f結(jié)構(gòu)光學模塊.系統(tǒng)照明光源是鹵素燈白光光源，采用科勒照明光路，并將顯微鏡照明數(shù)值孔徑設置到最小，以獲得部分空間相干光，使之滿足干涉條件.被測樣品被近似平面光波場照明，并通過顯微物鏡顯微放大成像.在它的像平面放置一塊黑白光柵以產(chǎn)生多級衍射光，每一級光均包含了物體的全部空間信息.通過透鏡L1對衍射光波場進行傅里葉變換，在透鏡的焦平面可以得到各級頻譜分布.在該頻譜面放置一個如圖1所示的濾波器，其中針孔濾波器對0級光進行低通濾波，使直流信息通過，作為參考光波場；+1級濾波器讓+1級光全部通過，從而得到完整的物光場信息.最后通過透鏡L2進行逆傅里葉變換，在CCD像平面，物光場和參考光場干涉形成離軸干涉圖.透鏡L1和透鏡L2形成一個4f結(jié)構(gòu)的馬赫-曾德干涉儀.

被測樣品的頻帶受顯微物鏡衍射限制，在CCD 平面其最高頻率β為

(1)

式(1)中：k0=2π/λ0；λ0表示中心波長，574 nm；NAobj表示顯微物鏡數(shù)值孔徑；Mobj表示顯微物鏡放大倍數(shù)；M4f表示4f結(jié)構(gòu)橫向放大倍數(shù).基于離軸干涉圖的三項分離原則，光柵調(diào)制得到的參考光載頻至少為樣品最高頻率的3倍才能避免混頻.這樣，在CCD平面上，干涉信號的最高頻率至少為4β.同時為了滿足Nyquist采樣定理，CCD像素采樣頻率必須大于等于8β.系統(tǒng)中各光學元件的選擇要求如參考文獻[11].本系統(tǒng)采用的顯微物鏡為40x/0.75，因此,系統(tǒng)的橫向分辨率達到0.765 μm；光柵常數(shù)為7.500 μm；4f結(jié)構(gòu)橫向放大倍率M4f= 3.0；CCD相機像元間距a=3.45 μm×3.45 μm，像素數(shù)為2 248×2 048，可根據(jù)需要選擇成像區(qū)域的大小.

在CCD記錄面，假設物光波為Uo，參考光波為Ur，則可以得到干涉場的強度分布為

I(x,y)= |Uo(x,y)+Ur(x,y)|2=

(2)

對記錄的干涉圖作傅里葉變換，得到0級、±1級分離的頻譜圖，通過濾波操作，濾除0級和-1級頻譜，并將+1級移至中心，再作逆傅里葉變換，由于記錄的是像面干涉圖，直接得到物光波的復數(shù)場U(x,y).由該復數(shù)場得到相位分布：

(3)

式(3)中：Re表示取復振幅的實部;Im表示取虛部.但是，由反正切計算得到的相位值分布區(qū)間([-π,π] )是包裹相位值.因此，一般情況下，要得到物體的真實相位分布還通常需要利用二維解包裹算法得到展開的相位分布.本文采用基于離散余弦變換(DCT)的最小二乘相位解包裹算法[12],并為了消除由參考光波、顯微物鏡成像、系統(tǒng)像差及各種背景噪聲引起的附加相位因子，采用減去參考平面相位的方法進行相位補償[13].

2 系統(tǒng)成像準確度和噪聲測量

首先測量了系統(tǒng)的相位成像準確性，選用標準聚苯乙烯微球作為被測樣品進行成像測量.微球直徑為(2±5%) μm，折射率為1.59.取少量微球散落于載波片，滴入顯微物鏡浸油(折射率為1.518)浸沒微球，并蓋上蓋波片.將此標準樣品放入載物臺，進行調(diào)焦，使之成像于CCD相機平面.記錄的干涉圖如圖2(a)所示，圖2(b)是2(a)矩形框所選部分的放大圖，圖2(c)是干涉圖2(a)的頻譜圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對樣品干涉圖和參考干涉圖分別進行數(shù)據(jù)處理,得到展開相位分布，并進行相位相減，得到相位像，如圖2(d)所示.利用已知的微球折射率和浸油折射率，由測量的相位分布可以計算得到微球形貌，如圖2(e)所示.圖2(f)是沿圖2(d)中所畫過微球中心直線的微球厚度分布截線圖，證實了組建的白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)具有準確的定量相位成像性能.

圖2 標準聚苯乙烯微球?qū)嶒灲Y(jié)果

同時測量了系統(tǒng)的時空噪聲.時空噪聲是測量系統(tǒng)的一個重要參數(shù)，直接影響系統(tǒng)的測量敏感度，即決定系統(tǒng)能夠測量的最小光程變化.在移除樣品的情況下，以20 幀/s的速度記錄了257 張干涉圖，像素數(shù)為1 024×1 024.將第1幀干涉圖作為參考干涉圖，對所有的干涉圖作數(shù)據(jù)處理，得到256 張相位圖.利用相位和光程的關(guān)系，繼而得到256張光程分布圖.對任一張光程分布圖求均方差，得到空間噪聲均低于0.60 nm.對所有256張光程分布圖作時間堆積，然后做空間均方差，得到時間噪聲，時間噪聲小于0.04 nm.因此，該系統(tǒng)具有很高的時空敏感度.

3 活體生物細胞相位成像

3.1 血紅細胞相位成像

圖3 血紅細胞相位成像

血紅細胞作為血液中個數(shù)最多的血細胞，具有運輸氧氣與二氧化碳的功能.血紅細胞形態(tài)和動態(tài)特性的研究和檢測，對臨床診斷和病理研究具有重要意義.正常成熟的人血紅細胞(直徑只有6～8 μm)是“甜甜圈”型，中間下凹，邊緣較厚，并且沒有細胞核等細胞器，富含血紅蛋白.從實驗室健康成年男性指尖取少許血液，滴入質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水中，保證血紅細胞的活性和正常生理活動.用移液管取1 μL的溶液，滴到載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品.將樣品放到載物臺上，并待血紅細胞粘滯到載玻片上后，對血紅細胞聚焦成像.圖3(a)為記錄的干涉圖，圖3(b)是3(a)矩形框所選部分的放大圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對樣品干涉圖和參考干涉圖分別進行數(shù)據(jù)處理得到展開相位分布，并進行相位相減，得到相位像，如圖3(c)所示.圖3(d)是3(c)矩形框中單個血紅細胞相位分布的三維圖.圖3(e)是沿著圖3(c)中過血紅細胞中心的直線所示的血紅細胞相位分布曲線.

3.2 大腸桿菌相位成像

大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌，其結(jié)構(gòu)成桿狀，分裂方式為二分分裂.取微量大腸桿菌擴散在水中，用移液管取1 μL的溶液，滴在載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品.圖 4(a)為大腸桿菌干涉圖，圖4(b)是4(a)矩形框所選部分的放大圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對樣品干涉圖和參考干涉圖分別進行數(shù)據(jù)處理得到展開相位分布，并進行相位相減，得到相位像，如圖4(c) 所示.圖 4(d)是4(c)矩形框 1 中單個大腸桿菌的相位分布放大圖，該大腸桿菌未開始分裂.圖4(e)是4(c)矩形框 2 中單個大腸桿菌的相位分布放大圖，該大腸桿菌已明顯地處于二分裂狀態(tài).

圖4 大腸桿菌相位成像

3.3 生物細胞時間序列相位成像

霉菌繁殖迅速，常造成食品及用具的大量霉腐變質(zhì)，但也有許多有益種類，如紅曲霉便是有益種類中的一種.紅曲霉能產(chǎn)生大量的天然紅色素，并能產(chǎn)生有益降膽固醇、降血壓等物質(zhì)，因而已受到研究者的廣泛關(guān)注.紅曲霉孢子呈球形或橢圓形，大小為(6.5～10.5) μm× (7.0～9.0) μm.取微量紅曲霉孢子擴散在水中，用移液管取1 μL的溶液，滴在載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品，在室溫(25 ℃左右)下長時間觀察.首先在不放置樣品時，記錄一張干涉圖，作為參考干涉圖.然后放入樣品，每間隔5 min記錄一張干涉圖，連續(xù)記錄24 h.圖5是某孢子開始萌發(fā)后每隔15 min的重建相位像序列，可以看到孢子的萌發(fā)過程，正在形成孢子管.證明了該系統(tǒng)具有連續(xù)穩(wěn)定的獲取生物細胞定量相位像的能力.

圖 5 孢子萌發(fā)的動態(tài)相位像序列

4 結(jié) 論

構(gòu)建了基于白光衍射的定量顯微相位成像系統(tǒng)，并進行了生物活體細胞的成像研究.結(jié)果表明，該系統(tǒng)可以很好地應用于生物細胞的定量相位成像，尤其是該系統(tǒng)采用的白光照明，對生物細胞沒有任何的損傷，適用于長期的生物活體細胞探測.因此，該系統(tǒng)在生物細胞定量測量方面很有優(yōu)勢，為活體細胞的動態(tài)研究提供了一種很有效的手段，期望為早期醫(yī)學診斷和藥物研發(fā)等提供一定的分析評價依據(jù).