劉春瑩，王一茜，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

海洋占地球表面積約71%，由于特殊的生存環(huán)境，海洋微生物能產生陸棲微生物所不能產生的結構新穎、作用特殊的生物活性物質，有較大的潛力應用于醫(yī)療、食品、環(huán)境保護等各個領域[1-2]，因此開發(fā)具有全新性質的酶已成為國際酶制劑研究的熱點[3]。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）EC l.1.3.4在氧氣存在的條件下能夠催化葡萄糖產生葡萄糖酸和H2O2，具有去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用[4-5]。1999年我國農業(yè)部將GOD定為12種允許使用的飼料酶制劑添加劑之一，是十分重要的工業(yè)酶之一[6-7]。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國對GOD的需求量逐年上升，但我國GOD主要依賴進口。GOD具有去除飼料中霉菌毒素、延長飼料保質期、提高飼料養(yǎng)分消化率和替代抗生素等作用，可調節(jié)畜禽腸道pH、保護腸道上皮細胞完整、減少應激損傷、促進生長、降低死亡率等性能[8-11]，已成為研究學者和養(yǎng)殖企業(yè)關注的焦點。

黃曉月等[12]通過單因素試驗及響應面法對產GOD的海洋細菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化，結果表明，該菌的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31℃、接種量8%、轉速200 r/min、發(fā)酵時間60 h，酶活為優(yōu)化前的1.5倍。郭云瑕等[13]通過單因素試驗對經過紫外誘變后的黑曲霉進行發(fā)酵條件優(yōu)化，結果表明，發(fā)酵溫度30℃、接種量5%、轉速160 r/min、發(fā)酵時間72 h為產GOD的最優(yōu)發(fā)酵條件，酶活為優(yōu)化前的9.56倍。HAQIU等[14]對紫外誘變后的黑曲霉進行優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活約為之前的2倍。范新蕾等[15]通過響應面法對產GOD的黑曲霉菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活為優(yōu)化前的1.93倍。

GOD在動物、植物和微生物體內均有廣泛地分布[16]。國內外GOD的來源主要為陸地來源的多為霉菌及其工程菌的生產菌株[17]，其培養(yǎng)溫度大多為30～40℃[18]，分離純化困難，生產成本高且無法直接應用于食品領域。酵母菌具有安全性高、易培養(yǎng)、易于純化，生產成本低等特點[19]，但酵母菌源的GOD的研究近乎空白。因此從海洋中篩選出產低溫GOD的酵母菌，對擴充資源庫具有重要意義。本研究以大連黃海海域海泥為樣本進行海洋低溫酵母菌的篩選，并對其發(fā)酵條件（碳源及濃度，有機氮源、無機氮源及濃度，初始pH及發(fā)酵溫度等進行單因素及正交試驗研究，為實現低溫GOD的產業(yè)化生產提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品和試劑

海泥：大連黃海海域（123.396°E，36.7014°N，深度6～20 m）；蛋白Marker：美國Thermo Fisher Scientific公司；鄰聯(lián)茴香胺：美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（60 U/mL）：生工生物工程（上海）股份有限公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：大連TaKaRa公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集（種子）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，海水配制，pH自然；121℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，蛋白胨3g/L，NaNO34g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，CaCO33.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，KI 1.7 g/L，脫氧膽酸鈉0.2 g/L，瓊脂 20 g/L，海水配制，pH 5.6；121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO34 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，CaCO310 g/L，海水配制，pH 5.6；121℃滅菌20 min。

菌種保藏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10g/L，瓊脂20g/L，海水配制，pH自然；121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；HD-1360超凈工作臺：北京悅泰行科技發(fā)展有限公司；THZ-312臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精勝科學儀器設備有限公司；BZ-01顯微鏡：德國徠卡公司；Multiskan FC酶標儀：美國THERMO FISHER公司；pHB-4p酸度計：上海升隆電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產低溫GOD酵母菌的分離篩選

取1 g海泥樣品在無菌操作條件下加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，25℃、160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)24 h。

用無菌海水將富集培養(yǎng)液從10-1依次稀釋至10-6，分別吸取10-4、10-5、10-6三個梯度稀釋液200 μL均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。挑取菌落周圍出現藍紫圈的酵母菌株，接種到新的初篩培養(yǎng)基平板中劃線純化培養(yǎng)。

將純化好的具有藍紫圈的酵母菌株接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于25℃、160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結束后，取1 mL發(fā)酵液，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清即為粗酶液，測定GOD酶活力。

1.3.2 GOD酶活測定方法

葡萄糖氧化酶酶活的定義：在下述條件下，每1分鐘將1 μmol的β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸并生成過氧化氫所需的酶量為1個單位（U/mL）。

反應底物為100 μL 5%葡萄糖溶液、200 μL 0.07 g/L鄰聯(lián)茴香胺溶液、10 μL 0.1 g/L辣根過氧化物酶溶液的混合溶液[20-23]。將底物與10 μL GOD標準樣品或粗酶液分別于25℃溫育10min，然后將底物與酶液迅速混勻，用酶標儀測其在波長500 nm條件下測其吸光度值的變化值，每隔1 min測定一次，連續(xù)測定5 min。計算每分鐘吸光度值增加值的平均值ΔA。GOD酶活計算公式如下：

式中：EAGOD為葡萄糖氧化酶酶活，U/mL；ΔA：吸光度值的變化值；V1為反應液體積，mL；V2為樣品體積，mL；7.5為消光系數。

1.3.3 菌種保藏

斜面保藏：將篩選到的具有產GOD能力的酵母菌株分別接種到斜面保藏培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

甘油保藏：將篩選到的具有產GOD能力的酵母菌株分別接種到種子培養(yǎng)基上，25℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液與滅菌過的甘油混合，甘油終濃度為25%，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 菌株鑒定

（1）形態(tài)學鑒定

將篩選得到的產GOD酵母菌接種于固體培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)學特征，并在光學顯微鏡（10×100）及電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

（2）分子生物學鑒定

采用真菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，然后采用通用引物進行聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增及測序。將得到的菌株DNA序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）上進行BLAST比對，并下載相似性最大的序列和該屬內代表種，利用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[24-25]。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

培養(yǎng)基中營養(yǎng)源的種類及濃度對產酶均有不同程度的影響，選擇合適的營養(yǎng)源及其濃度可提高菌株產GOD的酶活。以GOD的酶活為考察指標，采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化擔子菌WYQ 23的最優(yōu)產酶條件。

單因素試驗：分別對碳源種類（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖）及添加量（2%、4%、6%、8%、10%）進行優(yōu)化；對有機氮源種類（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、玉米膏）及添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）進行優(yōu)化；對無機氮源種類（NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3）及添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）進行優(yōu)化；對無機鹽（KH2PO4、MgSO4、KCl、CaCO3）添加量分別進行優(yōu)化。對發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）和發(fā)酵溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）進行優(yōu)化，所有實驗均做3個平行。

正交試驗：在培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化的基礎上，以菌體產葡萄糖氧化酶的酶活為評價指標，選擇葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、NaNO3（C）添加量及發(fā)酵溫度（D）為影響因素，采用L9（34）正交設計進行試驗優(yōu)化，確定最佳產酶條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 產酶條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme production condition optimization

2 結果與分析

2.1 產低溫GOD酵母菌篩選

從海泥樣品中共分離到26株酵母菌，根據菌落形態(tài)及是否有藍紫圈最終獲得5株不同酵母菌。將這5株酵母菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中測定其酶活力，結果見表2。由表2可知，通過比較其酶活力，從中篩選出一株酶活最高的菌株WYQ23，該菌株酶活為0.66U/mL，其他菌株酶活為0.17～0.53U/mL。

表2 產低溫葡萄糖氧化酶菌株的篩選結果Table 2 Screening results of low temperature glucose oxidase producing strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌株WYQ 23在固體種子培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)生長，3～7 d后得到直徑約為4～10 mm的褐色的菌落。由圖1A可知，菌落呈圓形，扁平，較不透明，表面較光滑，正面與反面以及邊緣與中央部位的顏色較一致。由圖1B可知，菌株顯微鏡下呈卵圓形，與酵母菌鏡下形態(tài)一致。

圖1 菌株WYQ 23的菌落形態(tài)（A）及細胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain WYQ 23

2.2.2 分子生物學鑒定

將菌株WYQ 23的ITS區(qū)序列在NCBI中進行BLAST分析，利用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2可知，經比對，該菌株與Basidioascussp.相似度最高，達99%。因此，該菌株被鑒定為擔子菌（Basidioascussp.）。該菌株ITS區(qū)序列已申請GenBank號，為SUB4615397 Seq1 MK038973。

圖2 菌株WYQ 23基于ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain WYQ 23 based on ITS gene sequences

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對菌株WYQ 23產酶的影響

分別以6%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源，培養(yǎng)菌株WYQ 23，培養(yǎng)基中其他成分及含量均與發(fā)酵培養(yǎng)基一致。發(fā)酵培養(yǎng)后測其酶活，結果如圖3A所示。由圖3A可知，當葡萄糖為碳源時酶活最高，為0.66U/mL，蔗糖次之，為0.61 U/mL，當麥芽糖和乳糖為碳源時的酶活較低，當可溶性淀粉為碳源時酶活極低。因此菌株WYQ 23最適碳源為葡萄糖。在該基礎上，進一步研究了不同葡萄糖添加量對菌株WYQ23產酶的影響，結果如圖3B所示。由圖3B可知，當葡萄糖添加量＞4%時，GOD酶活隨著濃度升高而降低，當葡萄糖添加量＜4%時，GOD酶活也降低，因此，葡萄糖的最適添加量為4%。

圖3 不同碳源（A）及葡萄糖添加量（B）對菌株WYQ 23產酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sources(A)and glucose addition(B)on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.2 有機氮源對菌株WYQ 23產酶的影響

分別以0.3%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、玉米膏作為有機氮源，培養(yǎng)菌株WYQ 23，結果如圖4A所示。由圖4A可知，當有機氮源為蛋白胨時，GOD酶活最高為0.82U/mL，牛肉膏次之，為0.53 U/mL。當有機氮源為酵母粉、玉米膏或尿素時，其酶活較低。不同蛋白胨添加量對菌株WYQ 23產酶的影響，結果如圖4B所示。由圖4B可知，在蛋白胨添加量＜0.4%時，GOD酶活隨著濃度增加而增大；在蛋白胨添加量＞0.4%時，GOD酶活隨著濃度增加而降低。因此，蛋白胨最優(yōu)添加量為0.4%。

圖4 不同有機氮源（A）及蛋白胨添加量（B）對菌株WYQ 23產酶的影響Fig.4 Effects of different organic nitrogen sources(A)and peptone addition(B）on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.3 無機氮源對菌株WYQ 23產酶的影響

圖5 不同無機氮源（A）及NaNO3添加量（B）對菌株WYQ 23產酶的影響Fig.5 Effects of different inorganic nitrogen(A)and NaNO3addition(B)on enzyme production of strain WYQ 23

分別以0.4%的無機氮源NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3作為培養(yǎng)菌株WYQ 23，結果如圖5A所示。由圖5A可知，在無機氮源為NaNO3時GOD的酶活最高為0.94U/mL，KNO3次之，為0.77 U/mL。當無機氮源NH4Cl、（NH4）2SO4或NH4NO3，其酶活較低。不同NaNO3添加量對菌株WYQ 23產酶的影響，結果如圖5B所示。由如圖5B可知，在NaNO3濃度＜0.3%時，GOD酶活降低；在NaNO3濃度＞0.3%時，GOD酶活隨著濃度增加而降低。因此，NaNO3最優(yōu)添加量為0.3%。

2.3.4 無機鹽對菌株WYQ 23產酶的影響

分別對KH2PO4、MgSO4、KCl、CaCO3的添加量進行優(yōu)化，結果如圖6所示。由圖6可知，其最適添加量分別為MgSO40.07%、KCl 0.03%、KH2PO40.3%、CaCO30.6%。

圖6 KH2PO4（A）、KCl（B）、MgSO4（C）及CaCO3（D）添加量對菌株WYQ 23產酶的影響Fig.6 Effects of KH2PO4(A),KCl(B),MgSO4(C)and CaCO3(D)addition on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對菌株WYQ 23產酶的影響

不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化結果如圖7所示。由圖7可知，在初始pH＜6.0時，隨著初始pH的升高GOD酶活逐漸增加；在初始pH＞6.0時，隨著初始pH的升高GOD酶活逐漸下降；發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0時酶活力達到最高，為1.54 U/mL。因此，菌株WYQ 23的發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH值為6.0。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對菌株WYQ 23生長及產酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on growth and enzyme production of strain WYQ 23

2.3.6 發(fā)酵溫度對WYQ 23產酶的影響

不同發(fā)酵溫度優(yōu)化結果如圖8所示。由圖8可知，在發(fā)酵溫度低于25℃時，酶活隨著發(fā)酵溫度升高而升高；在發(fā)酵溫度高于25℃時，酶活隨著發(fā)酵溫度升高反而降低。因此，最優(yōu)發(fā)酵溫度為25℃。

圖8 發(fā)酵溫度對菌株WYQ 23產酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.7 正交試驗結果

根據單因素試驗優(yōu)化結果，因為葡萄糖、蛋白胨、NaNO3及發(fā)酵溫度對酶活影響較大，因此選擇葡萄糖、蛋白胨、NaNO3添加量及發(fā)酵溫度進行L9（34）正交設計，試驗結果見表3。由表3可知，根據極差值可知各因素對菌株WYQ 23產酶的影響次序為發(fā)酵溫度＞NaNO3添加量＞葡萄糖添加量＞蛋白胨添加量，最優(yōu)產酶條件組合為A2B1C2D2，即葡萄糖添加量4%，蛋白胨添加量0.3%，NaNO3添加量0.3%，發(fā)酵溫度25℃。在此優(yōu)化條件下，葡萄糖氧化酶酶活達到1.67 U/mL。

3 結論

本研究從大連黃海海域海泥樣品中篩選得到一株產低溫GOD的海洋酵母菌WYQ 23，對該菌株的ITS區(qū)進行同源性比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株為擔子菌Basidioascussp.。該菌株產低溫GOD最優(yōu)產酶條件：葡萄糖4%、蛋白胨0.3%、NaNO30.3%、CaCO30.6%、MgSO40.07%、KCl 0.03%、KH2PO40.3%，初始pH 6.0，發(fā)酵溫度25℃。在此優(yōu)化條件下，該菌株產低溫GOD酶活力達到1.67 U/mL，是優(yōu)化前的2.53倍。